Получение псевдотипированных вирусов гриппа птиц H5 методом трансфекции фосфата кальция и измерение нейтрализующей активности антител
Summary
Здесь мы описываем протокол упаковки псевдовирусов и измерения нейтрализующей активности антител.
Abstract
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают вспышки гриппа среди домашней и дикой птиц. Иногда люди также становятся его жертвами, что приводит к высокой смертности. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что они должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы оказываются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 HPAI. В этом протоколе описываются процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов псевдовирусной нейтрализации. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов.
Introduction
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают постоянные вспышки гриппа среди домашней птицы и диких птиц, что приводит к огромным социально-экономическим потерям в мировой птицеводческой промышленности. Иногда им заражаются и люди, сталкиваясь с высокой летальностью 1,2. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что им нельзя заниматься за пределами лабораторий уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы достаточно безопасны для применения в лабораториях 2-го уровня биобезопасности.
Псевдовирусы H5 HPAI относятся к химерным вирусам, состоящим из ядер суррогатных вирусов, липидных оболочек с поверхностными гликопротеинами вирусов гриппа и репортерных генов. Ядра псевдовирусов обычно получают из лентивирусного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), ретровирусов, таких как вирус мышиного лейкоза (MLV) и вирус везикулярного стоматита (VSV)3. В частности, система упаковки ВИЧ-1 широко используется для производства псевдовируса гриппа, где основными предоставленными генами являются gag и pol. Ген кляпа ВИЧ экспрессирует основные белки. Ген pol экспрессирует интегразу и обратную транскриптазу, обе из которых необходимы для экспрессии репортерного гена в трансдуцированных клетках. Имитируя геном суррогатного вируса, репортерный ген включается в ядро псевдовируса в форме РНК. Репортерный ген будет экспрессировать белок в клетках-хозяевах. Уровни экспрессии генов-репортеров могут быть использованы для измерения эффективности псевдовирусной инфекции 3,4. Основным репортером является люцифераза светлячка для измерения относительных единиц люминесценции (RLU) или относительной активности люциферазы (RLA) в трансдуцируемых клетках. Другие репортеры, такие как lacZ, Gaussia и люцифераза Renilla, также используются, только в меньшей степени5.
Псевдовирусы являются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 Hapi. Для измерения активности нейтрализующих антител используются анализы псевдовирусной нейтрализации (ПН)6. Гемагглютинин (ГК) и нейраминидаза (НА) являются гликопротеинами на поверхности вируса гриппа А 7,8. Гиалуроновая кислота состоит из домена глобулярной головки для связывания рецепторов и стволового домена для слияния мембран. Белок NA обладает сиалидазной активностью, облегчающей высвобождение вируса 7,8. Анализ ПН может измерять нейтрализующие антитела, направленные на белки ГК. Нейтрализующие антитела, направленные на головную и стволовую область ГК, также могут быть обнаружены с помощью анализов прикрепления и проникновения вируса. По сравнению с вирусами дикого типа эксперименты по нейтрализации псевдовирусов имеют более чувствительные значения обнаружения, могут безопасно обрабатываться в лаборатории биобезопасности уровня 2 и, как правило, легче работать на практике.
В этом протоколе подробно представлены процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов PN. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов. В этом исследовании в качестве примера использовался штамм A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) из вирусов H5N1 HPAI. Для получения иммунных сывороток, используемых в анализах, в этом протоколе был выбран белок HA, происходящий из штамма TH, в качестве иммуногена для иммунизации мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT клетки обычно используются в качестве упаковочных клеток для производства псевдовирусов. Регулярное обнаружение микоплазмы имеет важное значение во время культивирования клеток. Заражение микоплазмой может резко снизить выход псевдовируса, а иногда и близко к нулю. По сравнени?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Проекта по наращиванию инновационного потенциала провинции Цзянсу (BM2020019), Шэньчжэньского научно-технического проекта (No. JSGG20200225150702770), Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Гуандунский научно-технический проект (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076). SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
