Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos contínuos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens, sendo responsáveis por enormes perdas socioeconômicas na indústria avícola global. Algumas vezes, os seres humanos também se infectam com ela, diante de uma alta taxa de letalidade ^1,2. No entanto, a pesquisa do vírus da IAAP é frequentemente dificultada, uma vez que não pode ser manuseada fora dos laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus são seguros o suficiente para serem praticados em laboratórios de nível 2 de biossegurança.

Os pseudovírus H5 da GAAP pertencem a vírus quiméricos que consistem em núcleos de vírus substitutos, envelopes lipídicos com glicoproteínas de superfície de vírus influenza e genes repórteres. Os núcleos de pseudovírus são geralmente derivados do vírus da imunodeficiência humana lentiviral (HIV), retrovírus como o vírus da leucemia murina (MLV) e o vírus da estomatite vesicular (VSV)³. Especificamente, o sistema de embalagem do HIV-1 é amplamente utilizado para produzir pseudovírus influenza, onde os genes primários fornecidos são gag e pol. O gene da mordaça do HIV expressa proteínas centrais. O gene pol expressa a integrase e a transcriptase reversa, ambas necessárias para a expressão do gene repórter em células transduzidas. Mimetizando o genoma do vírus substituto, o gene repórter é abraçado no núcleo do pseudovírus na forma de RNA. O gene repórter expressará a proteína nas células hospedeiras. Os níveis de expressão gênica dos genes repórteres podem ser usados para medir a eficiência da infecção por pseudovírus ^3,4. O repórter primário é a luciferase de vagalume para medir as unidades de luminescência relativa (RLU) ou atividade relativa de luciferase (RLA) em células transduzidas. Outros repórteres como lacZ, Gaussia e Renilla luciferase também são usados, só que em menor grau⁵.

Os pseudovírus são ferramentas ideais para o estudo de anticorpos neutralizantes contra o vírus H5 HAPI. Para medir a potência do anticorpo neutralizante, ensaios de neutralização de pseudovírus (NP)⁶ são usados. A hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) são glicoproteínas da superfície do vírus influenza A ^7,8. O AH é composto por um domínio da cabeça globular para ligação ao receptor e um domínio do tronco para fusão da membrana. A proteína NA tem atividade de sialidase para facilitar a liberação do vírus ^7,8. Um ensaio de NP pode medir anticorpos neutralizantes direcionados às proteínas HA. Anticorpos neutralizantes direcionados para a região da cabeça e tronco do AH também podem ser detectados por ensaios de adesão e entrada viral. Em comparação com vírus selvagens, os experimentos de neutralização de pseudovírus têm valores de detecção mais sensíveis, podem ser manuseados com segurança em um laboratório de biossegurança de nível 2 e geralmente são mais fáceis de operar na prática.

Este protocolo apresenta em detalhes os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 da GAAP e ensaios de NP. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios. Neste estudo, a cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) do vírus H5N1 da GAAP foi usada como exemplo. Para a obtenção dos soros imunes utilizados nos ensaios, esse protocolo selecionou a proteína HA originária da cepa TH como imunogênio para imunizar camundongos.