הכנת נגיפי שפעת העופות H5 מסוג פסאודו עם שיטת העברת סידן פוספט ומדידת פעילות נטרול נוגדנים
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לאריזת פסאודו-וירוס ולמדידת פעילות נטרול נוגדנים.
Abstract
מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת בעופות ובעופות בר. לעיתים, גם בני אדם נופלים קורבן לכך, מה שמוביל לתמותה גבוהה. עם זאת, מחקר וירוס HPAI מעוכב לעתים קרובות, בהתחשב בכך שהוא חייב להיות מטופל בתוך מעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. Pseudoviruses להוכיח להיות הכלים האידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים HPAI H5. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים והצעדים הקריטיים של ההכנות הפסאודו-וירוס H5 HPAI ומבחני נטרול פסאודו-וירוס. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה.
Introduction
מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת מתמשכות בעופות ובעופות בר, ואחראים להפסדים סוציו-אקונומיים עצומים בתעשיית העופות העולמית. לפעמים, בני אדם גם נדבקים בו, מתמודדים עם שיעור תמותה גבוה 1,2. עם זאת, מחקר וירוס HPAI הוא לעתים קרובות מעוכב, בהתחשב בכך שזה לא יכול להיות מטופל מחוץ למעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. פסאודו-וירוסים בטוחים מספיק כדי להתאמן במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2.
פסאודו-וירוסים H5 HPAI שייכים לנגיפים כימריים המורכבים מליבות וירוסים חלופיים, מעטפות שומנים עם פני השטח של גליקופרוטאינים מנגיפי שפעת, וגנים מדווחים. ליבות פסאודו-וירוס נגזרות בדרך כלל מנגיף הכשל החיסוני האנושי הלנטי-ויראלי (HIV), רטרו-וירוסים כגון וירוס לוקמיה מורין (MLV) ונגיף סטומטיטיס שלפוחית השתן (VSV)3. באופן ספציפי, מערכת האריזה של HIV-1 נמצאת בשימוש נרחב לייצור פסאודו-וירוס שפעת, שבו הגנים העיקריים שסופקו הם gag ו– pol. גן ה- HIV gag מבטא חלבוני ליבה. הגן pol מבטא את האינטגראז ואת השעתוק ההפוך, שניהם נחוצים לביטוי הגן המדווח בתאים מותמרים. תוך חיקוי הגנום של הנגיף החלופי, הגן המדווח מאומץ לתוך ליבת הפסאודו-וירוס בצורת RNA. גן הכתב יבטא את החלבון בתאים המארחים. ניתן להשתמש ברמות ביטוי הגנים של גנים מדווחים כדי למדוד יעילות זיהום פסאודו-וירוס 3,4. המדווח העיקרי הוא לוציפראז גחלילית כדי למדוד את יחידות הלומינסנציה היחסית (RLU) או פעילות הלוציפראז היחסית (RLA) בתאים מותמרים. כתבים אחרים כגון lacZ, Gaussia, ו Renilla luciferase משמשים גם, רק במידה פחותה5.
פסאודו-וירוסים הם כלים אידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד נגיפי H5 HAPI. כדי למדוד את עוצמת הנוגדנים המנטרלים, נעשה שימוש במבחני ניטרול פסאודו-וירוס (PN)6. Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם גליקופרוטאינים על פני השטח של שפעת A וירוס 7,8. ה-HA מורכב מתחום ראש כדורי לקשירת קולטנים ותחום גזע לאיחוי ממברנה. חלבון NA יש את פעילות sialidase כדי להקל על שחרור וירוס 7,8. בדיקת נוירופתיה היקפית יכולה למדוד נוגדנים מנטרלים המופנים לחלבוני HA. נוגדנים מנטרלים המכוונים לאזור הראש והגזע של HA יכולים להיות מזוהים גם על ידי התקשרות נגיפית ומבחני כניסה. בהשוואה לנגיפים מסוג פראי, לניסויי נטרול פסאודו-וירוסים יש ערכי זיהוי רגישים יותר, ניתן לטפל בהם בבטחה במעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2, ובדרך כלל קלים יותר לתפעול בפועל.
פרוטוקול זה מציג בפירוט את הנהלים והצעדים הקריטיים של H5 HPAI pseudovirus ההכנות ומבחני PN. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה. במחקר זה, זן A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) מנגיפי H5N1 HPAI שימש כדוגמה. כדי להשיג את סרה החיסון המשמשת בבדיקות, פרוטוקול זה בחר בחלבון HA שמקורו בזן TH כאימונוגן לחיסון עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי HEK293FT משמשים בדרך כלל כתאי אריזה לייצור פסאודו-וירוסים. זיהוי מיקופלסמה קבוע חיוני במהלך תרבית התא. זיהום מיקופלסמה יכול להפחית באופן דרסטי את תפוקת הפסאודו-וירוס ולפעמים קרוב לאפס. בהשוואה לזיהומים אחרים, זיהומי מיקופלסמה אינם מובילים לשינויים בערך ה- pH או לעכירות של מדיום תרבית התא. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר מפרויקט בניית יכולת החדשנות של מחוז ג’יאנגסו (BM2020019), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של שנזן (לא. JSGG20200225150702770), תוכנית מחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDB29030103), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של גואנגדונג (מס ‘2020B1111340076) ותוכנית המחקר הפתוח של מעבדת מפרץ שנזן (לא. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
