Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.
Abstract
Depuis 1996, les virus H5 de la lignée A/oie/Guangdong/1/96-lignée hautement pathogène (IAHP) sont à l’origine d’épidémies de grippe chez les volailles et les oiseaux sauvages. Parfois, les humains en sont également victimes, ce qui entraîne une mortalité élevée. Néanmoins, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle doit être traitée dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus s’avèrent être les outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus IAHP H5. Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests.
Introduction
Depuis 1996, les virus H5 de la grippe aviaire hautement pathogène (IAHP) de la lignée A/oie/Guangdong/1/96 sont à l’origine d’épidémies de grippe continuelles chez les volailles et les oiseaux sauvages, ce qui représente d’énormes pertes socio-économiques dans l’industrie mondiale de la volaille. Parfois, les humains sont également infectés par elle, confrontés à un taux de mortalité élevé 1,2. Cependant, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle ne peut pas être traitée en dehors des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus sont suffisamment sûrs pour être pratiqués dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2.
Les pseudovirus IAHP H5 appartiennent à des virus chimériques constitués de noyaux de virus de substitution, d’enveloppes lipidiques avec les glycoprotéines de surface des virus de la grippe et de gènes rapporteurs. Les carottes de pseudovirus sont généralement dérivées du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) lentivirale, des rétrovirus tels que le virus de la leucémie murine (MLV) et du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV)3. Plus précisément, le système d’emballage du VIH-1 est largement utilisé pour produire le pseudovirus de la grippe, où les principaux gènes fournis sont gag et pol. Le gène gag du VIH exprime les protéines centrales. Le gène pol exprime l’intégrase et la transcriptase inverse, toutes deux nécessaires à l’expression du gène rapporteur dans les cellules transduites. Imitant le génome du virus de substitution, le gène rapporteur est intégré dans le noyau du pseudovirus sous forme d’ARN. Le gène rapporteur exprimera la protéine dans les cellules hôtes. Les niveaux d’expression génique des gènes rapporteurs peuvent être utilisés pour mesurer l’efficacité de l’infection pseudovirale 3,4. Le rapporteur principal est la luciférase luciole pour mesurer les unités de luminescence relative (RLU) ou l’activité relative de la luciférase (RLA) dans les cellules transduites. D’autres rapporteurs tels que lacZ, Gaussia et Renilla luciferase sont également utilisés, mais dans une moindre mesure5.
Les pseudovirus sont des outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus H5 HAPI. Pour mesurer le pouvoir neutralisant des anticorps, les tests de neutralisation des pseudovirus (PN)6 sont utilisés. L’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) sont des glycoprotéines présentes à la surface du virus de la grippe A 7,8. Le HA est composé d’un domaine de tête globulaire pour la liaison au récepteur et d’un domaine souche pour la fusion membranaire. La protéine NA a l’activité sialidase pour faciliter la libération du virus 7,8. Un test NP peut mesurer des anticorps neutralisants dirigés contre les protéines HA. Les anticorps neutralisants dirigés contre la tête et la région souche de l’HA peuvent également être détectés par des tests de fixation et d’entrée virales. Par rapport aux virus de type sauvage, les expériences de neutralisation des pseudovirus ont des valeurs de détection plus sensibles, peuvent être manipulées en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 et sont généralement plus faciles à utiliser dans la pratique.
Ce protocole présente en détail les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests PN. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests. Dans cette étude, la souche A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) des virus IAHP H5N1 a été utilisée comme exemple. Pour obtenir les sérums immunitaires utilisés dans les essais, ce protocole a sélectionné la protéine HA provenant de la souche TH comme immunogène pour immuniser les souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT cellules sont généralement utilisées comme cellules d’emballage pour produire des pseudovirus. Une détection régulière des mycoplasmes est essentielle lors de la culture cellulaire. La contamination par les mycoplasmes peut diminuer considérablement les rendements de pseudovirus et parfois proche de zéro. Par rapport à d’autres contaminations, les contaminations par mycoplasmes n’entraînent pas de changements de la valeur du pH ou de turbidité du milieu de culture cellulaire. Même une forte con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche du Projet de renforcement des capacités d’innovation de la province du Jiangsu (BM2020019), du Projet scientifique et technologique de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), le Projet scientifique et technologique du Guangdong (n° 2020B1111340076) et le Programme de recherche ouvert du Laboratoire de la baie de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
