تحضير فيروسات أنفلونزا الطيور H5 من النوع الزائف بطريقة نقل فوسفات الكالسيوم وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة
Summary
هنا نصف بروتوكولا لتغليف الفيروسات الكاذبة وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة.
Abstract
ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بين الدواجن والطيور البرية. في بعض الأحيان ، يقع البشر أيضا ضحية لها ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، بالنظر إلى أنه يجب التعامل معها داخل مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. تثبت الفيروسات الزائفة أنها الأدوات المثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HPAI. يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة لاستعدادات الفيروس الكاذب H5 HPAI ومقايسات تحييد الفيروس الكاذب. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات.
Introduction
ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بشكل مستمر بين الدواجن والطيور البرية، مما يتسبب في خسائر اجتماعية واقتصادية هائلة في صناعة الدواجن العالمية. في بعض الأحيان ، يصاب البشر أيضا به ، ويواجهون معدل وفيات مرتفع 1,2. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، نظرا لأنه لا يمكن معالجتها خارج مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. الفيروسات الزائفة آمنة بما يكفي للممارسة في مختبرات السلامة الأحيائية من المستوى 2.
تنتمي الفيروسات الكاذبة H5 HPAI إلى فيروسات وهمية تتكون من نوى فيروسات بديلة ، ومغلفات دهنية مع البروتينات السكرية السطحية من فيروسات الأنفلونزا ، وجينات المراسل. عادة ما يتم اشتقاق نوى الفيروسات الكاذبة من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، والفيروسات القهقرية مثل فيروس سرطان الدم الفئران (MLV) ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) 3. على وجه التحديد ، يستخدم نظام التعبئة والتغليف HIV-1 على نطاق واسع لإنتاج فيروس الأنفلونزا الكاذب ، حيث الجينات الأساسية المقدمة هي gag و pol. يعبر جين هفوة فيروس نقص المناعة البشرية عن البروتينات الأساسية. يعبر جين بول عن إنزيم الانتراز وإنزيم النسخ العكسي، وكلاهما ضروري للتعبير عن جين المراسل في الخلايا المحولة. محاكاة جينوم الفيروس البديل ، يتم احتضان جين المراسل في قلب الفيروس الكاذب في شكل الحمض النووي الريبي. سيعبر جين المراسل عن البروتين في الخلايا المضيفة. يمكن استخدام مستويات التعبير الجيني لجينات المراسل لقياس كفاءة عدوى الفيروس الكاذب 3,4. المراسل الأساسي هو لوسيفيراز اليراع لقياس وحدات التلألؤ النسبية (RLU) أو نشاط اللوسيفيراز النسبي (RLA) في الخلايا المحولة. كما يتم استخدام مراسلين آخرين مثل lacZ و Gaussia و Renilla luciferase ، فقط بدرجة أقل5.
الفيروسات الزائفة هي أدوات مثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HAPI. لقياس قوة تحييد الأجسام المضادة ، يتم استخدام مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PN)6. الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) هي بروتينات سكرية على سطح فيروس الأنفلونزاA 7,8. يتكون HA من مجال رأس كروي لربط المستقبلات ومجال جذعي للاندماج الغشائي. يحتوي بروتين NA على نشاط sialidase لتسهيل إطلاق الفيروس 7,8. يمكن لفحص PN قياس الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى بروتينات HA. يمكن أيضا اكتشاف الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى الرأس ومنطقة الجذع من HA عن طريق فحوصات الارتباط الفيروسي والدخول. بالمقارنة مع الفيروسات البرية ، فإن تجارب تحييد الفيروس الكاذب لها قيم كشف أكثر حساسية ، ويمكن التعامل معها بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 ، وهي عموما أسهل في العمل في الممارسة العملية.
يعرض هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراءات والخطوات الحاسمة لمستحضرات الفيروس الكاذب H5 HPAI وفحوصات PN. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات. وفي هذه الدراسة، استخدمت كمثال على ذلك السلالة A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) من فيروسات H5N1 HPAI. للحصول على الأمصال المناعية المستخدمة في المقايسات ، اختار هذا البروتوكول بروتين HA الناشئ من سلالة TH كمناعي لتحصين الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما تستخدم الخلايا HEK293FT كخلايا تغليف لإنتاج فيروسات كاذبة. الكشف المنتظم عن الميكوبلازما ضروري أثناء زراعة الخلايا. يمكن أن يقلل تلوث الميكوبلازما بشكل كبير من غلة الفيروس الكاذب وأحيانا يقترب من الصفر. بالمقارنة مع الملوثات الأخرى ، لا تؤدي ملوثات الميكوبلازما إلى تغيرات في قيمة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية المقدمة من مشروع بناء القدرات الابتكارية لمقاطعة جيانغسو (BM2020019) ، ومشروع شنتشن العلمي والتكنولوجي (No. JSGG20200225150702770) ، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103) ، ومشروع قوانغدونغ العلمي والتكنولوجي (رقم 2020B1111340076) وبرنامج البحوث المفتوحة لمختبر خليج شنتشن (رقم. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
