Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений

Нервно-мышечное соединение млекопитающего (NMJ) представляет собой большой холинергический трехсторонний синапс, состоящий из нервного окончания двигательного нейрона, постсинаптической мембраны на скелетно-мышечном волокне и концевые шванновские клетки^1,2,3. Этот синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность^4,5,6,7,8даже во взрослом возрасте, когда NMJ могут подвергаться динамическим структурным модификациям. Например, некоторые исследователи показали, что двигательные нервные окончания постоянно меняют свою форму на микрометровом масштабе^9. Также сообщалось, что морфология NMJ реагирует на функциональные требования, измененное использование, старение, физические упражнения или изменения в двигательной активности^{4,10,11,12,13,14,15.} Таким образом, тренировка и отсутствие использования представляют собой существенный стимул для изменения некоторых характеристик NMJ, таких как его размер, длина, дисперсия синаптических везикул и рецепторов, а также ветвление нервных терминалов^{14,16,17,18,19,20.}

Кроме того, было показано, что любое структурное изменение или дегенерация этого жизненно важного соединения может привести к гибели клеток двигательных нейронов и атрофии мышц^21. Также считается, что измененная связь между нервами и мышцами может быть ответственна за физиологические возрастные изменения NMJ и, возможно, за его разрушение в патологических состояниях. Демонтаж нервно-мышечного соединения играет решающую роль в возникновении бокового амиотрофического склероза (БАС), нейродегенеративного заболевания, которое представляет собой один из лучших примеров нарушения взаимодействия мышц и нервов^3. Несмотря на многочисленные исследования, проведенные по дисфункции двигательных нейронов, до сих пор обсуждается, происходит ли ухудшение, наблюдаемое при БАС, из-за прямого повреждения двигательного нейрона, а затем распространяется на кортико-спинальные проекции^22; или если его следует рассматривать как дистальную аксонопатию, при которой дегенерация начинается в нервных окончаниях и прогрессирует в сторону двигательных нейронов сомы^23,24. Учитывая сложность патологии БАС, логично считать, что происходит смешение самостоятельных процессов. Поскольку NMJ является центральным игроком в физиопатологическом взаимодействии между мышцами и нервами, его дестабилизация представляет собой ключевую точку в происхождении заболевания, которая имеет отношение к анализу.

Нервно-мышечная система млекопитающего функционально организована в дискретные двигательные единицы, состоящие из двигательного нейрона и мышечных волокон, которые исключительно иннервируются его нервным концом. Каждый двигательный блок имеет волокна со сходными или идентичными структурно-функциональными свойствами^25. Селективный набор двигательных нейронов позволяет оптимизировать реакцию мышц на функциональные требования. Теперь ясно, что скелетные мышцы млекопитающих состоят из четырех различных типов волокон. Некоторые мышцы названы в соответствии с характеристиками их наиболее распространенного типа волокон. Например, камбала (задняя мышца задней конечности, участвующей в поддержании осанки тела) несет на себе большинство медленно дергающихся единиц (тип 1) и распознается как медленная мышца. Вместо этого экстензор digitorum longus (EDL) по существу состоит из блоков с аналогичными свойствами быстрого подергивания (волокна типа 2) и известен как быстрая мышца, специализированная для фазовых движений, необходимых для передвижения. Другими словами, хотя взрослые мышцы пластичны по своей природе из-за гормональных и нервных влияний, их состав волокон определяет способность выполнять различные виды деятельности, как видно на камбале, которая испытывает непрерывную низкоинтенсивную активность, и EDL, которая демонстрирует более быстрое одиночное подергивание. Другие признаки, которые варьируются среди различных типов мышечных волокон, связаны с их структурой (содержание митохондрий, расширение саркоплазматического стикулума, толщина линии Z), содержанием АТФазы миозина и составом тяжелой цепи миозина^26,27,28,29.

Для NMJ грызунов существуют значительные различия между мышцами^28,29. Морфометрический анализ, проведенный в камбуше и EDL у крыс, выявил положительную корреляцию между синаптической областью и диаметром волокна (т. Е. Синаптическая область в медленных волокнах камбуша больше, чем в быстрых волокнах EDL), но соотношение между площадью NMJ и размером волокна одинаково в обеих мышцах^30,31. Кроме того, по отношению к нервным окончаниям абсолютные области концевой пластины в волокнах типа 1 были ниже, чем в волокнах типа 2, тогда как нормализация по диаметру волокна сделала области нервных окончаний в волокнах типа 1 самыми большими^32.

Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на морфометрическом анализе, чтобы показать доказательства изменений в некоторых компонентах NMJ^33,34. Таким образом, в связи с актуальностью НМЮ в функции организма, морфология и физиология которого изменяются при различных патологиях, важно оптимизировать протоколы рассечения разных типов мышц с достаточно качественным качеством, позволяющим визуализировать всю структуру НМЮ. Также необходимо оценить возникновение пред- или постсинаптических изменений в различных экспериментальных ситуациях или состояниях, таких как старение или физические упражнения^35,36,37,38. Кроме того, может быть полезно провести более тонкие изменения в компонентах NMJ, такие как измененное фосфорилирование нейрофиламента в терминальных нервных окончаниях, как сообщается в ALS^39.