Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann^1,2,3. Questa sinapsi presenta un’elevata plasticità morfologica e funzionale^4,5,6,7,8,anche durante l’età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamiche. Ad esempio, alcuni ricercatori hanno dimostrato che le terminazioni nervose motorie cambiano continuamente la loro forma alla scala micrometrica⁹. È stato anche riferito che la morfologia della NMJ risponde a requisiti funzionali, uso alterato, invecchiamento, esercizio fisico o variazioni nell’attività^{locomotoria 4,10,11,12,13,14,15}. Pertanto, l’allenamento e la mancanza di utilizzo rappresentano uno stimolo essenziale per modificare alcune caratteristiche della NMJ, come le sue dimensioni, lunghezza, dispersione di vescicole sinaptiche e recettori, così come la ramificazione terminale^{nervosa 14,16,17,18,19,20}.

Inoltre, è stato dimostrato che qualsiasi cambiamento strutturale o degenerazione di questa giunzione vitale potrebbe causare la morte delle cellule dei motoneuroni e l’atrofia^{muscolare 21}. Si pensa anche che la comunicazione alterata tra nervi e muscoli potrebbe essere responsabile dei fisiologici cambiamenti di NMJ legati all’età e possibilmente della sua distruzione in stati patologici. Lo smantellamento della giunzione neuromuscolare gioca un ruolo cruciale nell’insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa che costituisce uno dei migliori esempi di interazione muscolo-nervosa compromessa³. Nonostante i numerosi studi condotti sulla disfunzione dei motoneuroni, si discute ancora se il deterioramento osservato nella SLA si verifichi a causa del danno diretto al motoneurone e poi si estenda alle proiezioni cortico-spinali^22; o se deve essere considerato come un’assonopatia distale in cui la degenerazione inizia nelle terminazioni nervose e progredisce verso il somas^{del motoneurone 23,24}. Data la complessità della patologia della SLA, è logico considerare che si verifica un mix di processi indipendenti. Poiché nmj è il protagonista dell’interazione fisiopatologica tra muscolo e nervo, la sua destabilizzazione rappresenta un punto cardne dell’origine della malattia che è rilevante per essere analizzata.

Il sistema neuromuscolare dei mammiferi è funzionalmente organizzato in unità motorie discrete, costituite da un motoneurone e dalle fibre muscolari che sono esclusivamente innervate dal suo terminale nervoso. Ogni unità motore ha fibre con proprietà strutturali e funzionali simili o identiche²⁵. Il reclutamento selettivo dei motoneuroni consente di ottimizzare la risposta muscolare alle esigenze funzionali. Ora è chiaro che i muscoli scheletrici dei mammiferi sono composti da quattro diversi tipi di fibre. Alcuni muscoli sono nominati in base alle caratteristiche del loro tipo di fibra più abbondante. Ad esempio, il soleo (un muscolo posteriore dell’arto posteriore coinvolto nel mantenimento della postura del corpo) porta la maggior parte delle unità a contrazione lenta (tipo 1) ed è riconosciuto come un muscolo lento. Invece, l’estensore digitorum longus (EDL) è essenzialmente composto da unità con proprietà simili a contrazione rapida (fibre di tipo 2) ed è noto come muscolo veloce specializzato per i movimenti fasici necessari per la locomozione. In altre parole, sebbene i muscoli adulti siano di natura plastica a causa delle influenze ormonali e neurali, la sua composizione in fibra determina la capacità di svolgere diverse attività, come si vede nel soleus che sperimenta un’attività continua a bassa intensità e L’EDL che mostra una singola contrazione più rapida. Altre caratteristiche che sono variabili tra i diversi tipi di fibre muscolari sono correlate alla loro struttura (contenuto mitocondriale, estensione del reticolo sarcoplasmatico, spessore della linea Z), contenuto di miosina ATPasi e composizione della catena pesante della miosina^26,27,28,29.

Per i NMJ roditori, ci sono differenze significative tra i^{muscoli 28,29}. Le analisi morfometriche eseguite in soleus ed EDL dai ratti hanno rivelato una correlazione positiva tra l’area sinaptica e il diametro delle fibre (cioè, l’area sinaptica nelle fibre lente soleus è maggiore che nelle fibre veloci EDL) ma il rapporto tra l’area NMJ e la dimensione della fibra è simile in entrambi i^{muscoli 30,31}. Inoltre, in relazione ai terminali nervosi, le aree assolute della piastra terminale nelle fibre di tipo 1 erano inferiori rispetto alle fibre di tipo 2, mentre la normalizzazione per diametro delle fibre ha reso le aree dei terminali nervosi nelle fibre di tipo 1 le^{più grandi 32}.

Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull’analisi morfometrica per mostrare l’evidenza dei cambiamenti in alcuni dei componenti^{NMJ 33,34}. Pertanto, a causa della rilevanza della NMJ nella funzione dell’organismo, la cui morfologia e fisiologia sono alterate in varie patologie, è importante ottimizzare i protocolli di dissezione di diversi tipi di muscoli con qualità sufficiente a consentire la visualizzazione dell’intera struttura NMJ. È inoltre necessario valutare il verificarsi di cambiamenti pre o postinaptici in diverse situazioni o condizioni sperimentali come l’invecchiamento o^{l’esercizio fisico 35,36,37,38}. Inoltre, può essere utile evidenzare alterazioni più sottili nei componenti NMJ come la fosforilazione del neurofilamento alterato nelle terminazioni nervose terminali come riportato nella SLA³⁹.