Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

De zoogdier neuromusculaire verbinding (NMJ) is een grote cholinerge tripartiete synaps bestaande uit de motor neuron zenuw einde, de postsynaptische membraan op de skelet spiervezel, en de terminale Schwann cellen^1,2,3. Deze synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit^4,5,6,7,8,zelfs tijdens de volwassenheid wanneer NMJ’s dynamische structurele wijzigingen kunnen ondergaan. Sommige onderzoekers hebben bijvoorbeeld aangetoond dat motorische zenuwuiteinden voortdurend van vorm veranderen op de micrometerschaal⁹. Er is ook gemeld dat de morfologie van de NMJ reageert op functionele vereisten, gewijzigd gebruik, veroudering, oefening of variaties in motorische activiteit^{4,10,11,12,13,14,15}. Training en gebrek aan gebruik vertegenwoordigen dus essentiële stimulansen om bepaalde kenmerken van de NMJ te wijzigen, zoals de grootte, lengte, dispersie van synaptische blaasjes en receptoren, evenals zenuwterminalvertakking^{14,16,17,18,19,20}.

Bovendien is aangetoond dat elke structurele verandering of degeneratie van deze vitale verbinding kan leiden tot motorneuronceldood en spieratrofie²¹. Er wordt ook gedacht dat veranderde communicatie tussen zenuwen en spieren verantwoordelijk kan zijn voor de fysiologische leeftijdsgebonden NMJ-veranderingen en mogelijk voor de vernietiging ervan in pathologische toestanden. Neuromusculaire junction ontmanteling speelt een cruciale rol bij het begin van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), een neurodegeneratieve ziekte die een van de beste voorbeelden is van verminderd spier-zenuwspel³. Ondanks de talrijke studies uitgevoerd op motorneurondisfunctie, wordt nog steeds gediscussieerd of de verslechtering waargenomen in ALS optreedt als gevolg van de directe schade in het motorneuron en zich vervolgens uitstrekt tot de cortico-spinale projecties²²; of als het moet worden beschouwd als een distale axonoopathie waarbij degeneratie begint in de zenuwuiteinden en vordert naar het motorneuron somas^23,24. Gezien de complexiteit van ALS-pathologie is het logisch om te overwegen dat er een mix van onafhankelijke processen plaatsvindt. Aangezien NMJ de centrale speler is van het fysiopathologische samenspel tussen spier en zenuw, vertegenwoordigt de destabilisatie ervan een cruciaal punt in de oorsprong van de ziekte dat relevant is om te worden geanalyseerd.

Het neuromusculaire systeem van zoogdieren is functioneel georganiseerd in discrete motorische eenheden, bestaande uit een motorneuron en de spiervezels die uitsluitend door de zenuwterminal worden geinvat. Elke motorunit heeft vezels met vergelijkbare of identieke structurele en functionele eigenschappen²⁵. Motorneuron selectieve rekrutering maakt het mogelijk om de spierrespons op functionele eisen te optimaliseren. Nu is het duidelijk dat skeletspieren van zoogdieren uit vier verschillende vezeltypen bestaan. Sommige spieren worden genoemd volgens de kenmerken van hun meest voorkomende vezeltype. Bijvoorbeeld, de soleus (een achterste spier van de achterste ledemaat betrokken bij het behoud van de lichaamshouding) draagt een meerderheid van slow-twitch eenheden (type 1) en wordt herkend als een langzame spier. In plaats daarvan bestaat extensor digitorum longus (EDL) in wezen uit eenheden met vergelijkbare fast-twitch-eigenschappen (type 2-vezels) en staat bekend als een snelle spier die gespecialiseerd is in phasische bewegingen die nodig zijn voor voortbeweging. Met andere woorden, hoewel volwassen spieren plastic van aard zijn vanwege de hormonale en neurale invloeden, bepaalt de vezelsamenstelling het vermogen om verschillende activiteiten uit te voeren, zoals te zien is in soleus dat continue activiteit met lage intensiteit ervaart en EDL die een snellere enkele twitch vertoont. Andere kenmerken die variabel zijn tussen verschillende soorten spiervezels zijn gerelateerd aan hun structuur (mitochondriale inhoud, uitbreiding van sarcoplasmatisch reticulum, dikte van de Z-lijn), myosine ATPase-gehalte en myosine zware kettingsamenstelling^26,27,28,29.

Voor knaagdier NMJ’s zijn er significante verschillen tussen spieren^28,29. Morfometrische analyses uitgevoerd in soleus en EDL van ratten toonden een positieve correlatie aan tussen het synaptische gebied en de vezeldiameter (d.w.z. het synaptische gebied in soleus langzame vezels is groter dan in EDL snelle vezels), maar de verhouding tussen NMJ-gebied en vezelgrootte is vergelijkbaar in beide spieren^30,31. Ook, met betrekking tot de zenuwterminals, waren de eindplaat absolute gebieden in type 1 vezels lager dan in type 2 vezels, terwijl de normalisatie door vezeldiameter gebieden van zenuwterminals in type 1 vezels de grootste³²maakte.

Er zijn echter maar weinig studies gericht op morfometrische analyse om het bewijs van veranderingen in sommige NMJ-componenten^{33,34 aan}te tonen . Vanwege de relevantie van de NMJ in de functie van het organisme, waarvan de morfologie en fysiologie in verschillende pathologieën worden gewijzigd, is het dus belangrijk om dissectieprotocollen van verschillende soorten spieren te optimaliseren met voldoende kwaliteit om de visualisatie van de hele NMJ-structuur mogelijk te maken. Het is ook noodzakelijk het optreden van pre – of postsynaptische veranderingen in verschillende experimentele situaties of omstandigheden zoals veroudering of oefening^35,36,37,38te evalueren . Bovendien kan het nuttig zijn om subtielere veranderingen in NMJ-componenten te bewijzen, zoals veranderde neurofilamentfosforylatie in de terminale zenuwuiteinden zoals gerapporteerd in ALS³⁹.