Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia
Summary
Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.
Abstract
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en humanos y se tratan rutinariamente con antibióticos empíricos. Sin embargo, debido al aumento de la resistencia microbiana, la eficacia de los antibióticos más utilizados ha disminuido. Para encontrar opciones de tratamiento alternativas, existe una gran necesidad de una mejor comprensión de la patogénesis de la ITU y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a la ITU. Para investigar esto en un modelo animal, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo para estudiar el curso de la ITU.
Durante años, el estándar de oro para la enumeración de la carga bacteriana ha sido la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) para un volumen de muestra particular. Esta técnica requiere homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Como alternativa, las imágenes de bioluminiscencia (BLI) están ganando popularidad para determinar la carga bacteriana. El etiquetado de patógenos con un operón lux permite la detección y cuantificación sensible de una manera no invasiva, lo que permite un seguimiento longitudinal. Hasta ahora, la adopción de BLI en la investigación de itunicas urinarias sigue siendo limitada.
Este manuscrito describe la implementación práctica de BLI en un modelo de infección del tracto urinario de ratón. Aquí, se proporciona una guía paso a paso para el cultivo de bacterias, la instilación intravesical y la obtención de imágenes. Se examina la correlación in vivo con la UFCC y se proporciona una prueba de concepto comparando la carga bacteriana de los animales infectados no tratados con los animales tratados con antibióticos. Además, se discuten las ventajas, limitaciones y consideraciones específicas de la implementación de BLI en un modelo de ITU in vivo. La implementación de BLI en el campo de investigación de UTI facilitará en gran medida la investigación sobre la patogénesis de UTI y el descubrimiento de nuevas formas de prevenir y tratar UTI.
Introduction
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en los seres humanos. Casi la mitad de todas las mujeres experimentarán una infección urinaria sintomática durante su vida1. Las infecciones limitadas a la vejiga pueden dar lugar a síntomas urinarios como aumento de la frecuencia urinaria, urgencia, hematuria, incontinencia y dolor. Cuando la infección asciende al tracto urinario superior, los pacientes desarrollan pielonefritis, con malestar general, fiebre, escalofríos y dolor de espalda. Además, hasta el 20% de los pacientes con ITU sufren infecciones recurrentes que resultan en una disminución dramática de la sensibilidad a los antibióticos2,3,4. En los últimos años, ha habido un creciente interés en nuevas terapias para el tratamiento y la prevención de la ITU recurrente. A pesar de una mejor comprensión de la inmunidad innata y adaptativa del tracto urinario inferior y de los factores de virulencia bacteriana necesarios para la invasión y colonización, no se han traducido cambios radicales en el régimen de tratamiento a la práctica urológica diaria2. Para estudiar la patogénesis y la susceptibilidad in vivo delas itunicas urinarias, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo.
Se han descrito múltiples modelos de ITU animales que van desde nematodos hasta primates, pero el modelo murino se utiliza predominantemente5,6. Este modelo consiste en el cateterismo transuretral de ratones (hembras) y la posterior instilación de una suspensión bacteriana, más comúnmente uropatógena Escherichia coli (UPEC), directamente en la luz de la vejiga7. Después de la inoculación, la carga bacteriana se ha cuantificado tradicionalmente mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC). Esta técnica requiere el sacrificio de animales para obtener homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Además, el seguimiento longitudinal de la carga bacteriana en animales individuales no es posible utilizando esta técnica.
En 1995, Contag etal. sugirieron el uso de patógenos marcados con bioluminiscencia para monitorear los procesos de enfermedad en animales vivos8,9. Desde entonces, la imagen de bioluminiscencia (BLI) se ha aplicado a numerosos modelos de infección como meningitis, endocarditis, osteomielitis, infecciones de la piel y tejidos blandos, etc.10,11,12. En el modelo murino UTI, se puede utilizar una cepa UPEC con el operón lux completo(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens 13. Una reacción enzimática es catalizada por la luciferasa bacteriana que depende de la oxidación de aldehídos de cadena larga que reaccionan con el mononucleótido de flavina reducido en presencia de oxígeno, produciendo la flavina oxidada, un ácido graso de cadena larga y ligero12. El operón lux codifica para la luciferasa y otras enzimas necesarias para la síntesis de los sustratos. Por lo tanto, todas las bacterias metabólicamente activas emitirán continuamente luz verde azul (490 nm) sin necesidad de la inyección de un sustrato exógeno12. Los fotones emitidos por bacterias marcadas con luxse pueden capturar utilizando cámaras de dispositivos de carga acoplada (CCD) refrigeradas y altamente sensibles.
El uso de bacterias bioluminiscentes en un modelo para la ITU permite la cuantificación longitudinal y no invasiva de la carga bacteriana, omitiendo la necesidad de sacrificar animales en puntos de tiempo fijos durante el seguimiento para la determinación de ufc. A pesar de la amplia gama de posibilidades, la acumulación de evidencia de la robustez de esta técnica BLI en otros campos y sus ventajas sobre los modelos clásicos de ITU, no se ha implementado ampliamente en la investigación de UTI. El protocolo presentado aquí proporciona una guía detallada paso a paso y destaca las ventajas de BLI para toda la investigación futura de UTI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventajas de BLI en comparación con los recuentos de UFC
Datos longitudinales
Una desventaja importante del método tradicional de conteo de UFC para cuantificar la carga microbiana es el requisito de homogeneizados de órganos post mortem, que proporcionan solo un punto de datos transversal por animal. Por el contrario, el BLI permite un seguimiento longitudinal no invasivo de los animales infectados. Los animales pueden ser fotografiados de 2 a 3 veces al día, proporcionando una visión…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Investigación – Flandes (FWO Vlaanderen; G0A6113N), el Consejo de Investigación de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. y W.E.) y el VIB (a T.V.). W.E. es investigador clínico senior de la Fundación de Investigación – Flandes (FWO Vlaanderen). La cepa UTI89-lux fue un generoso regalo del laboratorio del Prof. Seed13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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