Продольное наблюдение за инфекциями мочевыводящих путей и их лечение у мышей с использованием биолюминесцентной визуализации
Summary
В данной рукописи описывается внутрипузырное введение уропатогенных бактерий с помощью люкс-оперона для индуцирования инфекции мочевыводящих путей у мышей и последующий продольный in vivo анализ бактериальной нагрузки с использованием биолюминесцентной визуализации.
Abstract
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к числу наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей и обычно лечатся эмпирическими антибиотиками. Однако из-за повышения микробной резистентности эффективность наиболее часто используемых антибиотиков снизилась. Чтобы найти альтернативные варианты лечения, существует большая потребность в лучшем понимании патогенеза ИМП и механизмов, определяющих восприимчивость к ИМП. Чтобы исследовать это на животной модели, необходим воспроизводимый, неинвазивный анализ для изучения течения ИМП.
В течение многих лет золотым стандартом для перечисления бактериальной нагрузки было определение колониеобразующих единиц (КОЕ) для конкретного объема образца. Этот метод требует посмертных гомогенатов органов и последовательных разбавлений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. В качестве альтернативы набирает популярность биолюминесцентная визуализация (BLI) для определения бактериальной нагрузки. Маркировка патогенов с помощью люкс-оперона позволяет осуществлять чувствительное обнаружение и количественную оценку неинвазивным способом, тем самым обеспечивая продольное наблюдение. До сих пор принятие BLI в исследованиях ИМП остается ограниченным.
Эта рукопись описывает практическую реализацию BLI в мышиной модели инфекции мочевыводящих путей. Здесь приведено пошаговое руководство по культивированию бактерий, внутрипузырной инстилляции и визуализации. Исследуется корреляция in vivo с КОЕ и обеспечивается доказательство концепции путем сравнения бактериальной нагрузки необработанных инфицированных животных с животными, обработанными антибиотиками. Кроме того, обсуждаются преимущества, ограничения и соображения, характерные для реализации BLI в модели in vivo UTI. Внедрение BLI в области исследований ИМП значительно облегчит исследования патогенеза ИМП и открытие новых способов профилактики и лечения ИМП.
Introduction
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей. Почти половина всех женщин будут испытывать симптоматическую ИМП в течение своей жизни1. Инфекции, ограниченные мочевым пузырем, могут привести к мочевым симптомам, таким как увеличение частоты мочеиспускания, срочность, гематурия, недержание мочи и боль. Когда инфекция поднимается в верхние мочевые пути, у пациентов развивается пиелонефрит, с недомоганием, лихорадкой, ознобом и болями в спине. Кроме того, до 20% пациентов с ИМП страдают от рецидивирующих инфекций, что приводит к резкому снижению чувствительности к антибиотикам2,3,4. В последние годы наблюдается растущий интерес к новым методам лечения и профилактики рецидивирующих ИМП. Несмотря на лучшее понимание врожденного и адаптивного иммунитета нижних мочевых путей и факторов бактериальной вирулентности, необходимых для инвазии и колонизации, никаких радикальных изменений в режиме лечения не было переведено в ежедневную урологическую практику2. Для изучения патогенеза ИМП и восприимчивости in vivoнеобходим воспроизводимый и неинвазивный анализ.
Было описано несколько моделей ИМП на животных, начиная от нематод и заканчивая приматами, но мышиная модель преимущественно используется5,6. Эта модель состоит из трансуретральной катетеризации (самок) мышей и последующей инстилляции бактериальной суспензии, чаще всего уропатогенной кишечной палочки (УПЭК), непосредственно в просвет мочевого пузыря7. После инокуляции бактериальная нагрузка традиционно количественно определяется путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот метод требует жертвоприношения животных для получения посмертных гомогенатов органов и последовательных разведений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. Кроме того, продольное наблюдение за бактериальной нагрузкой у отдельных животных невозможно с использованием этой методики.
В 1995 году Contag etal. предложили использовать биолюминесцентно-меченые патогены для мониторинга процессов заболевания у живых животных8,9. С тех пор биолюминесцентная визуализация (BLI) была применена к многочисленным моделям инфекций, таким как менингит, эндокардит, остеомиелит, инфекции кожи и мягких тканей и т. Д.10,11,12. В мышиной модели ИМП может быть использован штамм УПЭК с полным люкс-опероном (luxCDABE)от Photorhabdus luminescens 13. Ферментативная реакция катализируется бактериальной люциферазой, которая зависит от окисления длинноцепочечных альдегидов, реагирующих с восстановленным мононуклеотидом флавина в присутствии кислорода, в результате чего образуется окисленный флавин, длинноцепочечная жирная кислота и свет12. Люкс оперон кодирует люциферазу и другие ферменты, необходимые для синтеза субстратов. Поэтому все метаболически активные бактерии будут непрерывно излучать сине-зеленый (490 нм) свет без необходимости введения экзогенного субстрата12. Фотоны, испускаемые бактериями сметками люкс, могут быть захвачены с помощью высокочувствительных камер с охлаждаемой связью с зарядом (CCD).
Использование биолюминесцентных бактерий в модели ИМП позволяет проводить продольную, неинвазивную количественную оценку бактериальной нагрузки, исключая необходимость жертвоприношения животных в фиксированные моменты времени во время последующего наблюдения за определением КОЕ. Несмотря на широкий спектр возможностей, аккумулирующих доказательств надежности данной методики МПЖ в других областях и ее преимущества перед классическими моделями ИМП, она не получила широкого применения в исследованиях ИМП. Протокол, представленный здесь, предоставляет подробное пошаговое руководство и подчеркивает преимущества BLI для всех будущих исследований ИМП.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества BLI по сравнению с количеством КОЕ
Продольные данные
Основным недостатком традиционного метода подсчета КОЕ для количественной оценки микробной нагрузки является требование гомогенатов посмертных органов, обеспечивающих только одну точку поперечного с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Исследовательский совет KU Leuven (C1-TRPLe; Т.В. и В.Е.) и ВИБ (до Т.В.). В.Е. является старшим клиническим научным сотрудником Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen). Штамм UTI89-lux был щедрым подарком от лаборатории профессора Сида13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
