Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem
Summary
Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.
Abstract
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos e são tratadas rotineiramente com antibióticos empíricos. No entanto, devido ao aumento da resistência microbiana, a eficácia dos antibióticos mais usados diminuiu. Para encontrar opções alternativas de tratamento, há uma grande necessidade de uma melhor compreensão da patogênese DA UTI e dos mecanismos que determinam a suscetibilidade da UTI. Para investigar isso em um modelo animal, é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo para estudar o curso da UTI.
Durante anos, o padrão-ouro para a enumeração da carga bacteriana tem sido a determinação de Unidades de Formação de Colônias (UFC) para um determinado volume amostral. Esta técnica requer homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Como alternativa, a bioluminescência (BLI) está ganhando popularidade para determinar a carga bacteriana. A rotulagem de patógenos com um operon lux permite a detecção e quantificação sensíveis de forma não invasiva, permitindo assim o acompanhamento longitudinal. Até agora, a adoção da BLI na pesquisa da UTI permanece limitada.
Este manuscrito descreve a implementação prática de BLI em um modelo de infecção do trato urinário do rato. Aqui, é fornecido um guia passo-a-passo para a cultura de bactérias, instilação intravesical e imagem. A correlação in vivo com a UFC é examinada e uma prova de conceito é fornecida comparando a carga bacteriana de animais infectados não tratados com animais tratados com antibióticos. Além disso, são discutidas as vantagens, limitações e considerações específicas para a implementação da BLI em um modelo in vivo UTI. A implantação da BLI no campo de pesquisa da UTI facilitará muito a pesquisa sobre a patogênese da UTI e a descoberta de novas formas de prevenir e tratar a ITU.
Introduction
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos. Quase metade de todas as mulheres experimentarão uma UTI sintomática durante sua vida1. Infecções limitadas à bexiga podem dar origem a sintomas urinários como aumento da frequência urinária, urgência, hematuria, incontinência e dor. Quando a infecção sobe para o trato urinário superior, os pacientes desenvolvem pyelonephritis, com mal-estar, febre, calafrios e dor nas costas. Além disso, até 20% dos pacientes com UTI sofrem de infecções recorrentes, resultando em uma redução drástica na sensibilidade a antibióticos2,3,4. Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse por novas terapias para o tratamento e prevenção da UTI recorrente. Apesar de uma melhor compreensão da imunidade inata e adaptativa do trato urinário inferior e dos fatores de virulência bacteriana necessários para invasão e colonização, nenhuma mudança radical no regime de tratamento foi traduzida para a prática urológica diária2. Para estudar a patogênese e a suscetibilidade da UTI in vivo,é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo.
Vários modelos de UTI animal foram descritos variando de nematoides a primatas, mas o modelo murino é predominantemente usado5,6. Este modelo consiste em cateterismo transuretral de camundongos (femininos) e posterior instilação de suspensão bacteriana, mais comumente uropatogênica Escherichia coli (UPEC), diretamente no lúmen da bexiga7. Após a inoculação, a carga bacteriana tem sido tradicionalmente quantificada por determinação de unidades formadoras de colônias (UFC). Esta técnica requer sacrificar animais para obter homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Além disso, o acompanhamento longitudinal da carga bacteriana em animais individuais não é possível usando essa técnica.
Em 1995, Contag et al. sugeriram o uso de patógenos bioluminescentes marcados para monitorar processos de doenças em animais vivos8,9. Desde então, a bioluminescência (BLI) tem sido aplicada a inúmeros modelos de infecção, como meningite, endocardite, osteomielite, pele e infecções por tecidos moles, etc.10,11,12. No modelo murine UTI, pode ser utilizada uma cepa UPEC com o lux operon completo(luxCDABE)da Photorhabdus luminescens 13. Uma reação enzimática é catalisada pela luciferase bacteriana que depende da oxidação de aldeídos de cadeia longa reagindo com mononucleotídeo de flavin reduzido na presença de oxigênio, produzindo flavin oxidado, um ácido graxo de cadeia longa e luz12. Os códigos lux operon para a luciferase e outras enzimas necessárias para a síntese dos substratos. Portanto, todas as bactérias metabolicamente ativas emitirão luz verde azul (490 nm) sem a necessidade da injeção de um substrato exógeno12. Fótons emitidos por bactérias lux-taggedpodem ser capturados usando câmeras de dispositivo (CCD) altamente sensíveis e resfriadas.
O uso de bactérias bioluminescentes em um modelo para UTI permite a quantificação longitudinal e não invasiva da carga bacteriana, omitindo a necessidade de sacrificar animais em pontos de tempo fixos durante o acompanhamento para determinação da UFC. Apesar da ampla gama de possibilidades, acumulando evidências para a robustez desta técnica BLI em outros campos e suas vantagens sobre modelos clássicos de UTI, ela não foi amplamente implementada na pesquisa da UTI. O protocolo aqui apresentado fornece um guia passo a passo detalhado e destaca as vantagens da BLI para todas as futuras pesquisas da UTI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantagens da BLI em relação às contagens de UFC
Dados longitudinais
Uma grande desvantagem do método tradicional de contagem da UFC para quantificar a carga microbiana é a exigência de homogeneizações de órgãos post-mortem, fornecendo apenas um ponto de dados transversais por animal. Por outro lado, a BLI permite o acompanhamento longitudinal não invasivo de animais infectados. Os animais podem ser imagens de 2 a 3 vezes por dia, fornecendo uma visão detalhada da cinética da i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Research Foundation – Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), o Conselho de Pesquisa de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e o VIB (para T.V.). W.E. é um pesquisador clínico sênior da Research Foundation – Flanders (FWO Vlaanderen). A cepaUTI89-lux foi um presente generoso do laboratório13do Prof. Seed.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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