Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza
Summary
Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un’infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l’imaging a bioluminescenza.
Abstract
Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani e sono trattate di routine con antibiotici empirici. Tuttavia, a causa dell’aumento della resistenza microbica, l’efficacia degli antibiotici più utilizzati è diminuita. Per trovare opzioni di trattamento alternative, c’è un grande bisogno di una migliore comprensione della patogenesi UTI e dei meccanismi che determinano la suscettibilità UTI. Per indagare su questo in un modello animale, è indispensabile un test riproducibile e non invasivo per studiare il corso dell’UTI.
Per anni, il gold standard per l’enumerazione della carica batterica è stata la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) per un particolare volume di campione. Questa tecnica richiede omogeneizzati d’organo post-mortem e diluizioni seriali, limitando l’output e la riproducibilità dei dati. In alternativa, l’imaging a bioluminescenza (BLI) sta guadagnando popolarità per determinare la carica batterica. L’etichettatura dei patogeni con un operone lux consente il rilevamento e la quantificazione sensibili in modo non invasivo, consentendo così un follow-up longitudinale. Finora, l’adozione di BLI nella ricerca UTI rimane limitata.
Questo manoscritto descrive l’implementazione pratica di BLI in un modello di infezione del tratto urinario di topo. Qui viene fornita una guida passo-passo per la coltura di batteri, l’instillazione intravescicale e l’imaging. Viene esaminata la correlazione in vivo con i CFU e viene fornita una prova di concetto confrontando la carica batterica degli animali infetti non trattati con gli animali trattati con antibiotici. Inoltre, vengono discussi i vantaggi, i limiti e le considerazioni specifiche per l’implementazione di BLI in un modello UTI in vivo. L’implementazione di BLI nel campo della ricerca UTI faciliterà notevolmente la ricerca sulla patogenesi delle UTI e la scoperta di nuovi modi per prevenire e curare le UTI.
Introduction
Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani. Quasi la metà di tutte le donne sperimenterà una UTI sintomatica durante la loro vita1. Le infezioni limitate alla vescica possono dare origine a sintomi urinari come aumento della frequenza urinaria, urgenza, ematuria, incontinenza e dolore. Quando l’infezione sale al tratto urinario superiore, i pazienti sviluppano pielonefrite, con malessere, febbre, brividi e mal di schiena. Inoltre, fino al 20% dei pazienti con UTI soffre di infezioni ricorrenti con conseguente drastica diminuzione della sensibilità agli antibiotici2,3,4. Negli ultimi anni, c’è stato un crescente interesse per le nuove terapie per il trattamento e la prevenzione delle infezioni cardiache regressive. Nonostante una migliore comprensione dell’immunità innata e adattativa del tratto urinario inferiore e dei fattori di virulenza batterica necessari per l’invasione e la colonizzazione, nessun cambiamento radicale nel regime di trattamento è stato tradotto nella pratica urologica quotidiana2. Per studiare la patogenesi e la suscettibilità delle UTI in vivo,è indispensabile un test riproducibile e non invasivo.
Sono stati descritti più modelli di UTI animali che vanno dai nematodi ai primati, ma il modello murino è prevalentemente utilizzato5,6. Questo modello consiste nella cateterizzazione transuretrale di topi (femmina) e nella successiva instillazione di una sospensione batterica, più comunemente Escherichia coli uropatogena (UPEC), direttamente nel lume della vescica7. Dopo l’inoculazione, la carica batterica è stata tradizionalmente quantificata determinando le unità formanti colonie (CFU). Questa tecnica richiede il sacrificio di animali per ottenere omogeneizzati di organi post-mortem e diluizioni seriali, limitando l’output e la riproducibilità dei dati. Inoltre, il follow-up longitudinale della carica batterica nei singoli animali non è possibile utilizzando questa tecnica.
Nel 1995, Contag etal. hanno suggerito l’uso di agenti patogeni bioluminescenti per monitorare i processi patologici negli animali viventi8,9. Da allora, l’imaging a bioluminescenza (BLI) è stato applicato a numerosi modelli di infezione come meningite, endocardite, osteomielite, infezioni della pelle e dei tessuti molli, ecc.10,11,12. Nel modello murino UTI, un ceppo UPEC con l’operone lux completo (luxCDABE) di Photorhabdus luminescens può essere utilizzato13. Una reazione enzimatica è catalizzata dalla luciferasi batterica che dipende dall’ossidazione delle aldeidi a catena lunga che reagiscono con un ridotto mononucleotide flavina in presenza di ossigeno, producendo la flavina ossidata, un acido grasso a catena lunga e leggero12. L’operone lux codifica per la luciferasi e altri enzimi necessari per la sintesi dei substrati. Pertanto, tutti i batteri metabolicamente attivi emetteranno continuamente luce verde blu (490 nm) senza la necessità di iniezione di un substrato esogeno12. I fotoni emessi da batteri con tag luxpossono essere catturati utilizzando telecamere CCD (Charge-Coupled Device) altamente sensibili e raffreddate.
L’uso di batteri bioluminescenti in un modello per UTI consente la quantificazione longitudinale e non invasiva della carica batterica, omettendo la necessità di sacrificare animali in punti temporali fissi durante il follow-up per la determinazione del CFU. Nonostante l’ampia gamma di possibilità, accumulando prove per la robustezza di questa tecnica BLI in altri campi e i suoi vantaggi rispetto ai modelli classici di UTI, non è stata ampiamente implementata nella ricerca UTI. Il protocollo qui presentato fornisce una guida dettagliata passo-passo ed evidenzia i vantaggi di BLI per tutte le future UTI ricerche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantaggi di BLI rispetto ai conteggi CFU
Dati longitudinali
Uno dei principali svantaggi del metodo tradizionale di conteggio dei CFU per quantificare il carico microbico è il requisito degli omogeneizzati d’organo post-mortem, fornendo un solo punto di dati trasversale per animale. Al contrario, BLI consente un follow-up longitudinale non invasivo degli animali infetti. Gli animali possono essere ripresi 2 o 3 volte al giorno, fornendo informazioni dettagliate sulla cinetica dell’infezio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione per la ricerca – Fiandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), il Consiglio di ricerca di KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e il VIB (a T.V.). W.E. è un ricercatore clinico senior della Fondazione di ricerca – Fiandre (FWO Vlaanderen). Il ceppo UTI89-lux è stato un generoso dono del laboratorio del Prof. Seed13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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