מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה
Summary
כתב יד זה מתאר את הניהול התוך-עבזי של חיידקים אורופתיוגניים עם לוקס אופרון כדי לגרום לדלקת בדרכי השתן בעכברים ואת אורך האורך שלאחר מכן בניתוח vivo של העומס החיידקי באמצעות הדמיית ביו-לומינציה.
Abstract
זיהומים בדרכי השתן (UTI) מדורגים בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם ומטופלים באופן שגרתי באנטיביוטיקה אמפירית. עם זאת, בשל עמידות מיקרוביאלית גוברת, היעילות של האנטיביוטיקה הנפוצה ביותר ירדה. כדי למצוא אפשרויות טיפול חלופיות, יש צורך גדול בהבנה טובה יותר של פתוגנזה UTI ואת המנגנונים הקובעים רגישות UTI. על מנת לחקור את זה במודל בעלי חיים, הבדיקה הניתנת לשחזור, לא פולשנית כדי ללמוד את מהלך UTI היא הכרחית.
במשך שנים, תקן הזהב לספירת עומס חיידקים היה הקביעה של יחידות יוצרות מושבה (CFU) עבור נפח מדגם מסוים. טכניקה זו דורשת הומוגנטים של איברים לאחר המוות ודילול טורי, המגבילים את פלט הנתונים ואת יכולת הרבייה. כחלופה, הדמיית ביולומינציה (BLI) צוברת פופולריות כדי לקבוע את העומס החיידקי. תיוג פתוגנים עם לוקס אופרון מאפשר זיהוי וכימות רגישים באופן לא פולשני, ובכך מאפשר מעקב אורך. עד כה, האימוץ של BLI במחקר UTI נשאר מוגבל.
כתב יד זה מתאר את היישום המעשי של BLI במודל זיהום בדרכי השתן של העכבר. כאן, מדריך צעד אחר צעד עבור חיידקים culturing, הטמעה תוך-בסית והדמיה מסופק. המתאם in vivo עם CFU נבדק הוכחה של מושג מסופק על ידי השוואת העומס החיידקי של בעלי חיים נגועים מטופלים עם בעלי חיים מטופלים באנטיביוטיקה. יתר על כן, היתרונות, המגבלות והשיקולים הספציפיים ליישום BLI במודל IN VIVO UTI נדונים. היישום של BLI בתחום המחקר UTI יקל מאוד על המחקר על הפתוגנזה של UTI וגילוי דרכים חדשות למנוע ולטפל UTI.
Introduction
זיהומים בדרכי השתן (UTI) הם בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם. כמעט מחצית מכל הנשים יחוו UTI סימפטומטי במהלך חייהם1. זיהומים המוגבלים לשלפוחית השתן יכולים לגרום לתסמינים בדרכי השתן כגון עלייה בתדירות השתן, דחיפות, המטוריה, בריחת שתן וכאב. כאשר הזיהום עולה למערכת השתן העליונה, חולים לפתח pyelonephritis, עם חולשה, חום, צמרמורות, וכאבי גב. יתר על כן, עד 20% מהחולים עם UTI סובלים מזיהומים חוזרים ונשנים וכתוצאה מכךירידהדרמטית ברגישות לאנטיביוטיקה 2,3,4. בשנים האחרונות, יש עניין גובר בטיפולים חדשניים לטיפול ומניעה של UTI חוזר. למרות הבנה טובה יותר של החסינות המולדת וההסתגלותית של דרכי השתן התחתונות ושל גורמי ארס החיידקים הדרושים לפלישה ולקולוניזציה, לא תורגמו שינויים רדיקליים במשטר הטיפול לפרקטיקה האורולוגית היומית2. על מנת ללמוד UTI פתוגנזה ורגישות ב vivo, בדיקת שחזור ולא פולשנית היא הכרחית.
מספר דגמי UTI של בעלי חיים תוארו החל נמטודות לפרימטים, אבל מודל מורין משמש בעיקר5,6. מודל זה מורכב צנתור טרנסאורתרלי של עכברים (נקבה) והטמעה לאחר מכן של השעיה חיידקית, לרוב אורופתיגני Escherichia coli (UPEC), ישירות לתוך לומן שלפוחית השתן7. לאחר החיסון, העומס החיידקי כותם באופן מסורתי על ידי קביעת יחידות יוצרות מושבה (CFU). טכניקה זו דורשת הקרבת בעלי חיים כדי להשיג הומוגנטים איברים לאחר המוות ודילול סדרתי, הגבלת תפוקת נתונים ושחזור. יתר על כן, מעקב אורך של עומס חיידקים בבעלי חיים בודדים אינו אפשרי באמצעות טכניקה זו.
בשנת 1995, Contag et al. הציע את השימוש בפתוגנים מתויגים bioluminescent כדי לפקח על תהליכי מחלה בבעלי חיים8,9. מאז, הדמיית ביולומינציה (BLI) הוחלה על מודלים זיהום רבים כגון דלקת קרום המוח, אנדוקרדיטיס, דלקת מפרקים ניוונית, עור, זיהומים רקמות רכות, וכו’10,11,12. במודל UTI מורין, זן UPEC עם לוקס אופרון מלא (luxCDABE) מ Photorhabdus luminescens ניתן להשתמש13. תגובה אנזימטית מזורזת על ידי לוציפראז חיידקי התלוי בחמצון של אלדהידים ארוכי שרשרת המגיבים עם מונונונוקלאוטיד פלאבין מופחת בנוכחות חמצן, מניב את הפלבין המחומצן, חומצת שומן ארוכת שרשרת ואור12. לוקס אופרון מקודד עבור לוציפראז ואנזימים אחרים הנדרשים לסינתזה של המצעים. לכן, כל החיידקים הפעילים מטבולית פולטים ברציפות אור ירוק כחול (490 ננומטר) ללא צורך בהזרקת מצע אקסוגני12. פוטונים הנפלטים מחיידקים מתויגים בלוקסניתנים לצילום באמצעות מצלמות מכשירים רגישים מאוד, מקוררים (CCD).
השימוש בחיידקים ביו-זוהרים במודל עבור UTI מאפשר כימות אורך ולא פולשני של העומס החיידקי, תוך השמטת הצורך בהקרבת בעלי חיים בנקודות זמן קבועות במהלך המעקב אחר קביעת CFU. למרות מגוון רחב של אפשרויות, צובר ראיות לחוסנה של טכניקת BLI זו בתחומים אחרים ויתרונותיה על פני מודלים קלאסיים של UTI, זה לא יושם באופן נרחב במחקר UTI. הפרוטוקול המוצג כאן מספק מדריך מפורט שלב אחר שלב ומדגיש את היתרונות של BLI עבור כל מחקר UTI עתידי.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של BLI בהשוואה לספירת CFU
נתוני אורך
חיסרון מרכזי בשיטה המסורתית של ספירת CFU כדי לכמת את הנטל המיקרוביאלי הוא הדרישה של הומוגנטים איברים לאחר המוות, מתן נקודת נתונים חתך אחת בלבד לכל חיה. לעומת זאת, BLI מאפשר מעקב אורך לא פולשני של בעלי חיים נגועים. ניתן לדמיין את בעלי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר – פלנדריה (FWO Vlaanderen; G0A6113N), מועצת המחקר של KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. ו- W.E.) וה-VIB (ל- T.V.). W.E. הוא חוקר קליני בכיר של קרן המחקר – פלנדריה (FWO Vlaanderen). הזן UTI89-lux היה מתנה נדיבה ממעבדתו של פרופ ‘ זרע13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
