Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming
Summary
Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.
Abstract
Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij mensen en worden routinematig behandeld met empirische antibiotica. Door toenemende microbiële resistentie is de werkzaamheid van de meest gebruikte antibiotica echter afgenomen. Om alternatieve behandelingsopties te vinden, is er een grote behoefte aan een beter begrip van de pathogenese van UTI en de mechanismen die de gevoeligheid voor UTI bepalen. Om dit in een diermodel te onderzoeken, is een reproduceerbare, niet-invasieve test om het beloop van urineweginfecties te bestuderen onmisbaar.
Jarenlang was de gouden standaard voor het opsommen van bacteriële belasting de bepaling van Colony Forming Units (CFU) voor een bepaald monstervolume. Deze techniek vereist postmortale orgaanhomogenaten en seriële verdunningen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Als alternatief wint bioluminescentiebeeldvorming (BLI) aan populariteit om de bacteriële belasting te bepalen. Het labelen van pathogenen met een lux operon maakt de gevoelige detectie en kwantificering op een niet-invasieve manier mogelijk, waardoor longitudinale follow-up mogelijk wordt. Tot nu toe blijft de adoptie van BLI in UTI-onderzoek beperkt.
Dit manuscript beschrijft de praktische implementatie van BLI in een muis urineweginfectie model. Hier wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het kweken van bacteriën, intravesicale instillatie en beeldvorming. De in vivo correlatie met CFU wordt onderzocht en een proof-of-concept wordt geleverd door de bacteriële belasting van onbehandelde geïnfecteerde dieren te vergelijken met met antibiotica behandelde dieren. Verder worden de voordelen, beperkingen en overwegingen die specifiek zijn voor de implementatie van BLI in een in vivo UTI-model besproken. De implementatie van BLI in het UTI-onderzoeksveld zal het onderzoek naar de pathogenese van UTI en de ontdekking van nieuwe manieren om UTI te voorkomen en te behandelen aanzienlijk vergemakkelijken.
Introduction
Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij de mens. Bijna de helft van alle vrouwen zal tijdens hun leven een symptomatische urineweginfectie ervaren1. Infecties beperkt tot de blaas kunnen aanleiding geven tot urinewegsymptomen zoals toename van de urinefrequentie, urgentie, hematurie, incontinentie en pijn. Wanneer de infectie opstijgt naar de bovenste urinewegen, ontwikkelen patiënten pyelonefritis, met malaise, koorts, koude rillingen en rugpijn. Bovendien lijdt tot 20% van de patiënten met urineweginfecties aan terugkerende infecties, wat resulteert in een dramatische afname van de gevoeligheid voor antibiotica2,3,4. In de afgelopen jaren is er een groeiende belangstelling voor nieuwe therapieën voor de behandeling en preventie van terugkerende urineweginfecties. Ondanks een beter begrip van de aangeboren en adaptieve immuniteit van de lagere urinewegen en van de bacteriële virulentiefactoren die nodig zijn voor invasie en kolonisatie, zijn er geen radicale veranderingen in het behandelingsregime vertaald naar de dagelijkse urologische praktijk2. Om UTI pathogenese en gevoeligheid in vivo te bestuderen,is een reproduceerbare en niet-invasieve test onmisbaar.
Er zijn meerdere dierlijke UTI-modellen beschreven, variërend van nematoden tot primaten, maar het muizenmodel wordt voornamelijk gebruikt5,6. Dit model bestaat uit transurethrale katheterisatie van (vrouwelijke) muizen en daaropvolgende instillatie van een bacteriële suspensie, meestal uropathogene Escherichia coli (UPEC), rechtstreeks in het blaaslumen7. Na inenting wordt de bacteriële belasting traditioneel gekwantificeerd door kolonievormende eenheden (CFU) te bepalen. Deze techniek vereist het offeren van dieren om postmortemorgaanhomogenaten en seriële verdunningen te verkrijgen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Bovendien is longitudinale follow-up van de bacteriële belasting bij individuele dieren niet mogelijk met deze techniek.
In 1995 suggereerden Contag etal. het gebruik van bioluminescent-gelabelde pathogenen om ziekteprocessen bij levende dieren te volgen8,9. Sindsdien is bioluminescentiebeeldvorming (BLI) toegepast op tal van infectiemodellen zoals meningitis, endocarditis, osteomyelitis, huid- en wekedeleninfecties, enz.10,11,12. In het murine UTI-model kan een UPEC-stam met de complete lux operon (luxCDABE) van Photorhabdus luminescens worden gebruikt13. Een enzymatische reactie wordt gekatalyseerd door het bacteriële luciferase dat afhankelijk is van de oxidatie van langeketenaldehyden die reageren met gereduceerd flavine mononucleotide in aanwezigheid van zuurstof, wat het geoxideerde flavine, een lange-keten vetzuur en lichtoplevert 12. Het lux operon codeert voor de luciferase en andere enzymen die nodig zijn voor de synthese van de substraten. Daarom zullen alle metabolisch actieve bacteriën continu blauwgroen (490 nm) licht uitzenden zonder dat de injectie van een exogene substraat nodig is12. Fotonen die worden uitgezonden door lux-gelabeldebacteriën kunnen worden vastgelegd met behulp van zeer gevoelige, gekoelde CCD-camera’s (Charge Coupled Device).
Het gebruik van bioluminescente bacteriën in een model voor UTI maakt de longitudinale, niet-invasieve kwantificering van de bacteriële belasting mogelijk, waardoor de noodzaak om dieren op vaste tijdstippen op te offeren tijdens de follow-up voor CFU-bepaling wordt weggelaten. Ondanks het brede scala aan mogelijkheden, het verzamelen van bewijs voor de robuustheid van deze BLI-techniek op andere gebieden en de voordelen ervan ten opzichte van klassieke modellen van UTI, is het niet op grote schaal geïmplementeerd in het UTI-onderzoek. Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze handleiding en belicht de voordelen van BLI voor al het toekomstige UTI-onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voordelen van BLI ten opzichte van CFU-tellingen
Longitudinale gegevens
Een groot nadeel van de traditionele methode voor het tellen van KVE om microbiële belasting te kwantificeren, is de vereiste van postmortemorganogenaten, die slechts één transversaal gegevenspunt per dier opleveren. Omgekeerd maakt BLI niet-invasieve longitudinale follow-up van geïnfecteerde dieren mogelijk. De dieren kunnen 2 tot 3 keer per dag in beeld worden gebracht, waardoor gedetailleerd inzicht wordt verkre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek – Vlaanderen (FWO Vlaanderen; G0A6113N), de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. en W.E.) en de VIB (naar T.V.). W.E. is senior klinisch onderzoeker van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek – Vlaanderen (FWO Vlaanderen). De soort UTI89-lux was een gulle gift van prof. seed’s laboratorium13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
