المتابعة الطولية لالتهابات المسالك البولية وعلاجها في الفئران باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية
Summary
تصف هذه المخطوطة الإدارة داخل الجسم البولي للبكتيريا المسالك البولية مع لوكس أوبرون للحث على عدوى المسالك البولية في الفئران والتحليل الطولي اللاحق في الجسم الحي للعبء البكتيري باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية.
Abstract
التهابات المسالك البولية (UTI) رتبة بين العدوى البكتيرية الأكثر شيوعا في البشر ويتم علاجها بشكل روتيني مع المضادات الحيوية التجريبية. ومع ذلك ، بسبب زيادة المقاومة الميكروبية ، انخفضت فعالية المضادات الحيوية الأكثر استخداما. لإيجاد خيارات العلاج البديلة، هناك حاجة ماسة لفهم أفضل لمسببات الأمراض UTI والآليات التي تحدد قابلية التهاب المسالك البولية. من أجل التحقيق في هذا في نموذج حيواني ، لا غنى عن إجراء فحص غير جراحي قابل للاستنساخ لدراسة مسار التهاب المسالك البولية.
لسنوات، كان المعيار الذهبي لتعداد الحمل البكتيري هو تحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لحجم عينة معينة. تتطلب هذه التقنية تجانسات الأعضاء بعد الوفاة والتخفيفات التسلسلية ، مما يحد من إخراج البيانات وقابلية الاستنساخ. كبديل، يكتسب التصوير بالإضاءة الحيوية (BLI) شعبية لتحديد الحمل البكتيري. وسم مسببات الأمراض مع لوكس operon تسمح للكشف الحساسة وتكميم بطريقة غير الغازية، وبالتالي تمكين المتابعة الطولية. وحتى الآن، لا يزال اعتماد BLI في أبحاث التهاب المسالك البولية محدودا.
تصف هذه المخطوطة التطبيق العملي ل BLI في نموذج عدوى المسالك البولية للفأرة. هنا، يتم توفير دليل خطوة بخطوة لزراعة البكتيريا، والغرس داخل الزج والتصوير. يتم فحص الارتباط في الجسم الحي مع CFU ويتم توفير إثبات المفهوم من خلال مقارنة الحمل البكتيري للحيوانات المصابة غير المعالجة مع الحيوانات المعالجة بالمضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، تناقش مزايا وقيود واعتبارات محددة لتنفيذ BLI في نموذج UTI في الجسم الحي. إن تنفيذ BLI في مجال أبحاث التهاب المسالك البولية سيسهل بشكل كبير البحث في مسببات الأمراض في التهاب المسالك البولية واكتشاف طرق جديدة لمنع وعلاج التهاب المسالك البولية.
Introduction
التهابات المسالك البولية (UTI) هي من بين العدوى البكتيرية الأكثر شيوعا في البشر. ما يقرب من نصف جميع النساء سوف تواجه أعراض التهاب المسالك البولية خلالحياتهم 1. يمكن أن تؤدي العدوى التي تقتصر على المثانة إلى ظهور أعراض بولية مثل زيادة وتيرة البول والإلحاح والوبيلة الدموية وسلس البول والألم. عندما تصعد العدوى إلى المسالك البولية العليا ، يصاب المرضى بالتهاب البيلونفر ، مع الضيق والحمى والقشعريرة وآلام الظهر. وعلاوة على ذلك، ما يصل إلى 20٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية يعانون من التهابات متكررة مما أدى إلى انخفاض كبير فيحساسيةالمضادات الحيوية 2،3،4. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد في العلاجات الجديدة لعلاج والوقاية من التهاب المسالك البولية المتكرر. على الرغم من فهم أفضل للمناعة الفطرية والتكيفية للمسالك البولية السفلية وعوامل الفوعة البكتيرية اللازمة للغزو والاستعمار ، لم تترجم أي تغييرات جذرية في نظام العلاج إلى الممارسة اليومية للمسالك البولية2. من أجل دراسة مسببات الأمراض UTI وقابلية في الجسم الحي، لا غنى عن الفحص القابل للتكرار وغير الغازية.
وقد وصفت نماذج متعددة UTI الحيوانية تتراوح بين الديدان الخيطية إلى الرئيسيات، ولكن يستخدم في الغالب نموذج مورين5،6. هذا النموذج يتكون من القسطرة عبر مجرى البول من الفئران (أنثى) وغرس لاحقة من تعليق البكتيرية, الأكثر شيوعا uropathogenic إشريتشيا القولونية (UPEC), مباشرة في تجويف المثانة7. بعد التطعيم ، تم قياس الحمل البكتيري تقليديا من خلال تحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU). تتطلب هذه التقنية التضحية بالحيوانات للحصول على تجانسات الأعضاء بعد الوفاة والتخفيفات التسلسلية ، مما يحد من إخراج البيانات وقابلية التكاثر. وعلاوة على ذلك، المتابعة الطولية للعبء البكتيري في الحيوانات الفردية غير ممكن باستخدام هذه التقنية.
في عام 1995،اقترح Contag وآخرون استخدام مسببات الأمراض الموسومة بالإضاءة الحيوية لرصد عمليات المرض فيالحيواناتالحية 8و9. ومنذ ذلك الحين ، تم تطبيق التصوير الإضاءة الحيوية (BLI) على العديد من نماذج العدوى مثل التهاب السحايا والتهاب الشغاف والتهاب العظم والنقي والجلد والتهابات الأنسجة الرخوة ، وما إلى ذلك10،11،12. في نموذج مورين UTI، يمكن استخدام سلالة UPEC مع لوكسoperon كاملة (luxCDABE) من لومينسنس Photorhabdus 13. يتم تحفيز رد فعل أنزيمي من قبل لوسيفيراز البكتيري الذي يعتمد على أكسدة الألدهيدات طويلة السلسلة التي تتفاعل مع انخفاض أحادي النوكليوتيد الفلافين في وجود الأكسجين ، مما ينتج عنه فلافين مؤأكسد ، وحمض دهني طويل السلسلة وخفيف12. يقوم لوكس أوبيرون بترميز لوسيفيراز والإنزيمات الأخرى المطلوبة لتركيب الركائز. لذلك، فإن جميع البكتيريا النشطة الأيضية تنبعث منها باستمرار الضوء الأخضر الأزرق (490 نانومتر) دون الحاجة إلى حقن ركيزة خارجية12. يمكن التقاط الفوتونات المنبعثة من البكتيريا الموسومة باللوكسباستخدام كاميرات جهاز حساسة للغاية وباردة مقترنة بالشحن (CCD).
استخدام البكتيريا الإنارة الحيوية في نموذج لUTI يسمح للقياس الكمي الطولي، غير الغازية من الحمل البكتيري، وحذف الحاجة إلى التضحية بالحيوانات في نقاط زمنية محددة خلال متابعة لتحديد CFU. على الرغم من مجموعة واسعة من الاحتمالات، وتراكم الأدلة على قوة هذه التقنية BLI في مجالات أخرى ومزاياها على النماذج الكلاسيكية من التهاب المسالك البولية، فإنه لم يتم تنفيذها على نطاق واسع في البحوث UTI. يقدم البروتوكول المعروض هنا دليلا تفصيليا خطوة بخطوة ويسلط الضوء على مزايا BLI لجميع أبحاث UTI المستقبلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا BLI مقارنة بحسابات CFU
البيانات الطولية
ومن العيوب الرئيسية للطريقة التقليدية لحساب CFU لتحديد العبء الميكروبي شرط تجانس الأعضاء بعد الوفاة ، وتوفير نقطة بيانات مقطعية واحدة فقط لكل. وعلى العكس من ذلك، تمكن BLI من المتابعة الطولية غير الغازية للحيوانات المصابة. يمكن تصو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة البحوث – فلاندرز (FWO فلاندرين؛ G0A6113N)، مجلس البحوث في جامعة لوفين (C1-TRPLe؛ تي في و دبليو إي) وVIB (إلى T.V.). W.E. هو باحث سريري كبير في مؤسسة البحوث – فلاندرز (FWO فلاندرين). سلالة UTI89-لوكس كان هدية سخية من مختبر البروفيسور سيد13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
