DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi
Summary
Bu çalışma, mikroarray teknolojileri tarafından elde edilen DNA metilasyon verilerini yönetmek için iş akışını açıklamaktadır. Protokol, numune hazırlamadan veri analizine kadar olan adımları gösterir. Tüm prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve video önemli adımları göstermektedir.
Abstract
Obezite doğrudan yaşam tarzıyla bağlantılıdır ve hastalığın gelişimine katkıda bulunan adipogenez ve lipit depolama süreçlerinde değişikliklere neden olabilecek DNA metilasyon değişiklikleri ile ilişkilendirilmiştir. Obezitesi olan ve olmayan hastaların seçiminden epigenetik veri analizine kadar eksiksiz bir protokol sunuyoruz. Protokoldeki tüm adımlar bir pilot çalışmada test edildi ve doğrulandı. 15 bireyin Vücut Kitle İndeksine (VKİ) göre obezite ile sınıflandırıldığı çalışmaya 32 kadın katıldı (45.1 ± 5.4 kg / m2); 17 birey ise VKİ’ye göre obezitesiz olarak sınıflandırıldı (22.6 ± 1.8 kg/m2). Obezitesi olan grupta lineer regresyon analizi ile yağ kütlesi ile ilişkili 564 CpG bölgesi tespit edildi. CpG siteleri organizatör bölgelerindeydi. Diferansiyel analiz, obezitesi olan bireylerde 470 CpGs hipometillenmiş ve 94 hipermetillenmiş bölge buldu. En hipometillenmiş zenginleştirilmiş yollar RUNX, WNT sinyalizasyonu ve hipoksiye yanıttaydı. Hipermetillenmiş yollar insülin sekresyonu, glukagon sinyalizasyonu ve Ca2+ ile ilişkiliydi. Protokolün DNA metilasyon modellerini ve özellik ile ilişkili DNA metilasyonunu etkili bir şekilde tanımladığı sonucuna vardık. Bu paternler, adipogenezi ve lipit depolamasını etkileyen değiştirilmiş gen ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Sonuçlarımız, obezojenik bir yaşam tarzının insan DNA’sındaki epigenetik değişiklikleri destekleyebileceğini doğruladı.
Introduction
Büyük ölçekli omik teknolojiler, kronik hastalıkların çalışmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin ilginç bir özelliği, bilimsel topluluğa büyük miktarda üretilen verinin mevcudiyetidir. Bu nedenle, çalışmalar arasında teknik karşılaştırmaya izin vermek için protokollerin standartlaştırılması talebi ortaya çıkmıştır. Bu çalışma, DNA metilasyon verilerini elde etmek ve analiz etmek için bir protokolün standardizasyonunu önermektedir ve pilot bir çalışmayı uygulanmış bir örnek olarak kullanmaktadır.
Modern insan yaşam tarzlarında negatif enerji harcaması baskındır, bu da aşırı yağ dokusu birikimine ve dolayısıyla obezitenin gelişmesine yol açmaktadır¹. Birçok faktör, sedentarizm, yüksek kalorili diyetler ve stresli rutinler gibi obezite oranlarını artırmıştır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), 2016 yılında 1,9 milyar yetişkinin obez olduğunu tahmin etmektedir, bu da dünya nüfusunun% 20’sinden fazlasının 30 kg / m2’den fazla BMI2’ye sahip olduğu anlamına gelir. 2018’in en son güncellemesi, Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) obezite prevalansının %42’den yüksek olduğunu ortaya koymuştur3.
Epigenetik, kromozomal bölgelerin değişmiş aktivite durumlarını kaydetmek, işaret etmek veya sürdürmek için yapısal adaptasyonudur4. DNA metilasyonu, sitozin-guanozin dinükleotid bölgelerinde (CpG bölgeleri) 5-metilsitozin-pG (5mCpG) oluşturan geri dönüşümlü bir kimyasal değişikliktir. Transkripsiyon makinesinin DNA5,6,7,8’e erişimini düzenleyerek gen ekspresyonunu modüle edebilir. Bu bağlamda, hangi CpG bölgelerinin obezite ile ilişkili özelliklerle ilişkili olduğunu anlamak önemlidir9. Birçok faktör, bölgeye özgü DNA metilasyonunu destekleyebilir veya önleyebilir. DNA metiltransferazlar10 (DNTM’ler) ve on-on bir translokasyon (TET’ler) gibi bu işlem için gerekli enzimler, çevresel maruziyetler altında DNA metilasyonunu veya demetilasyonunu destekleyebilir11.
Son yıllarda DNA metilasyon çalışmalarına artan ilgi göz önüne alındığında, her soruyu tam olarak cevaplamak için en uygun analiz stratejisini seçmek, araştırmacıların temel bir endişesi olmuştur12,13,14. 450K DNA metilasyon dizisi, DNA metilasyon profilini belirlemek için 360’tan fazla yayında14 kullanılan en popüler yöntemdir. Bilinen genlerin %99’unda bulunan 485.000 CpG’ye kadar metilasyonunu belirleyebilir15. Bununla birlikte, bu dizi durduruldu ve 850.000 CpG sitesini kapsayan EPIC ile değiştirildi. Mevcut protokol hem 450K hem de EPIC16,17,18 için uygulanabilir.
Protokol, Şekil 1’de adım adım sunulmuştur ve aşağıdaki adımları içermektedir: popülasyon seçimi, örnekleme, deney hazırlama, DNA metilasyon boru hattı ve biyoinformatik analiz. Önerilen protokolün adımlarını göstermek için laboratuvarımızda yapılan bir pilot çalışma burada gösterilmiştir.
Şekil 1: Sunulan protokolün şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA metilasyon dizileri, maliyet-fayda oranları nedeniyle DNA metilasyonuna erişmek için en çok kullanılan yöntemlerdir14. Bu çalışma, Brezilyalı bir kohortta gerçekleştirilen bir pilot çalışmada DNA metilasyonunu değerlendirmek için ticari olarak temin edilebilen bir mikroarray platformu kullanan ayrıntılı bir protokolü tanımlamıştır. Pilot çalışmadan elde edilen sonuçlar, protokolün etkinliğini doğruladı. Şekil 3 , numune karşılaştırılabilirliğini ve tam bisülfit dönüşümünü göstermektedir32.
Bir kalite kontrol adımı olarak ChAMP algoritması, filtreleme işlemi sırasında CpGs sitelerinin hariç tutulmasını önerdi. Probları hariç tutmanın amacı, veri analizini geliştirmek ve önyargıyı ortadan kaldırmaktır. Veri kümesindeki deneysel gürültüyü ortadan kaldırmak için düşük kaliteli CpG’ler (0,05’ten düşük p-değerleri) kaldırıldı. Hedefler yoğunluk grafiği analizinde geçilmeye devam etti. Zhou33, uyumsuzlukları, polimorfik sitozinlerin metilasyonunun yanlış yorumlanmasını ve tip I prob tasarımının anahtar rengine neden olmasını önlemek için SNP’lerin yakınında CpG’lerin filtrelenmesinin önemini açıkladı34. Ayrıca, XY kromozomları baskıdan farklı şekilde etkilendiğinden, Heiss ve Just35 bu probların filtrelenmesinin önemini güçlendirdi, çünkü kadınlarda hibridizasyon ile ilgili sorunlar kafa karıştırıcı faktörler olabilir35.
DMAP’lerin son kullanma tarihi, formamid açılış tarihi, mutlak etanolün analitik kalitesi ve toplam lökosit sayıları protokolde kritik adımlar olarak kabul edilir.
Ayrıca, gözlemlerimize göre, hücre tipi tahmini, biyoinformatik analizin gerçekleştirilmesinde esastır. Houseman yöntemi, Tian’ın çalışmasında açıklandığı gibi hücre tipi tahminini gerçekleştirir30. Bu yöntem, granülositler, monositler, B hücreleri ve T hücreleri gibi en önemli hücre tiplerinin yüzdelerini tahmin edebilen 473 spesifik CpG bölgesine dayanmaktadır36. ChAMP paketinden önerilen “myRefbase” işlevini kullandık. Tahminden sonra, ChAMP algoritması beta değerlerini ayarlar ve bu önyargıyı veri kümesinden kaldırır. Bu adım, obeziteye odaklanan çalışmalarda çok önemlidir, çünkü bu popülasyonun kronik enflamatuar durumları nedeniyle beyaz kan hücrelerinde önemli bir farkı vardır.
Ortak PCR mührünün orijinal kapak haritasını yalnızca yöntem modifikasyonu ve sorun giderme ile değiştirdik. Her santrifüjleme işleminden sonra, conta yenisi için değiştirildi. Standart ısı sızdırmazlığını kullanamadık ve plakanın etrafındaki alüminyum folyo kullanarak uyarladık.
Ticari tahliller epigenetik çalışmalar için altın standart olarak kabul edilmesine rağmen, protokolün bir sınırlaması, benzersiz bir markadan reaktiflerin ve ekipmanın özgüllüğü olabilir37,38,39,40. Diğer bir sınırlama, deneyin doğru ilerlemesinin belirlenmesine izin veren göstergelerin eksikliğidir41.
Mevcut protokolün standardizasyonu, epigenetik araştırmalar için harika bir rehber teşkil eder, süreç boyunca insan hatalarını azaltır ve başarılı veri analizi ve farklı çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik sağlar.
Sonuçlarımıza göre, DNA metilasyon deneyleri, obezitesi olan ve olmayan bireyleri karşılaştıran çalışmalar için uygundur43. Ayrıca, önerilen biyoinformatik analiz yüksek kaliteli veriler sağladı ve büyük ölçekli çalışmalarda dikkate alınabilir.
SVD analizini kullanarak, obezite ile ilişkili özelliklerin (BMI, WC ve FM) DNA metilasyon verilerindeki değişkenliği etkilediğini belirledik. Anlamlı bir sonuç olarak, hücre tipi tahmini, hem doğal öldürücü hücrelerin (NK) hem de B hücrelerinin obezitesi olan kadınlarda obezitesi olmayan kadınlara göre daha yüksek olduğunu göstermektedir (Şekil 5). Bu hücrelerin daha yüksek sayımları, bu bireylerin düşük dereceli enflamatuar durumu ile açıklanabilir44. Obeziteli hastaların yağ kütlesi ile ilişkili genlerin promotör bölgelerinde hipo- ve hipermetillenmiş CpG’lere sahip olduklarını gözlemledik. Bölgelerin çoğu hipometilasyona uğradı, bu da bu bireylerdeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerindeki doğal artışla ilişkili olabilir. Bu oksidatif stres durumu, dinükleotid bölgesinde guanin perturbanzını teşvik edebilir, 8-hidroksi-2′-deoksiguanozin (8-OHdG) oluşturabilir, 5mCp-8-OHdG dinükleotid bölgesi ile sonuçlanır ve TET enzimlerinin işe alınmasına neden olur. Tüm bu olaylar, DNA hipometilasyonunu ve hipermetilasyonunu farklı etki mekanizmalarıyla teşvik etmekten sorumlu olabilir45.
Ek olarak, obezitesi olan bireylerde adipogenez oranının arttığı, yeni hücrelerin yaklaşık% 10’unun eski hücrelere olduğu görülmektedir46,47. Obezojenik ortamı vurgulayan epigenetik katkılar, hücrelerin çoğalma ve farklılaşma oranlarını değiştirebilir ve yağ kütlesinin gelişimini destekleyebilir48. Epigenetik değişiklikler ayrıca adipojenik programları etkileyebilir, gelişimlerini kolaylaştırabilir veya kısıtlayabilir. Birincil transkripsiyon faktörleri (PPARγ veya C / EBPa) veya epigenetik modifiye edici enzimleri dahil ederek veya hariç tutarak çalıştırılan aşağı akış promotör bölgelerinde konumlandırılmış multiprotein komplekslerinin montajı, hiper veya hipometilasyon yoluyla gen ekspresyonunu düzenler45. PPARγ yolu, bu çalışmada zenginleştirilmiş genlere sahip olan WNT yolunu değiştirmek için daha önce tanımlanmıştır. WNT sinyallemesinin adipogenez sırasında nasıl gerçekleştiği hala bilinmemekle birlikte, son çalışmalar özellikle obezojenik koşullar altında adiposit metabolizmasında önemli rollere sahip olabileceğini bildirmiştir49.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ChAMP paketiyle ilgili tüm şüpheleri cevaplamaya hazır olduğu için Ph.D. Yuan Tian’a (tian.yuan@ucl.ac.uk) teşekkür ederiz. Ayrıca, bu makaledeki hem teknik hem de bilimsel konulara katkılarından dolayı Guilherme Telles, Msc.’ye teşekkür ederiz; epigenetik, video yakalama ve biçimlendirme teknikleri ile ilgili önemli hususlarda bulunmuştur (guilherme.telles@usp.br). Sarf Malzemeleri Finansmanı: São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP) (#2018/24069-3) ve Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq: #408292/2018-0). Kişisel finansman: (FAPESP: #2014/16740-6) ve Yüksek Öğretim Personel Gelişimi Koordinasyonundan Akademik Mükemmellik Programı (CAPES: 88882.180020/2018-01). Veriler kısıtlama olmaksızın kamuya açık ve serbestçe erişilebilir hale getirilecektir. NYN (e-posta: nataliayumi@usp.br) veya CBN (e-posta: carla@fmrp.usp.br) ile adres yazışmaları.
Materials
| Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
| Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
| Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
| EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
| HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
| Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
| MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
| MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
| NaOH | F. MAIA | 114700 | |
| PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
| PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
| 2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
| RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
| RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
| STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
| TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
| Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
| XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
| XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
| XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
| XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |
References
- Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
- . Obesity Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017)
- Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021)
- Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
- Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
- Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
- Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
- Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
- Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
- Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
- Yong, W. -. S., Hsu, F. -. M., Chen, P. -. Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
- Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
- Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
- Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
- Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
- Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
- Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
- Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
- Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020)
- Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
- Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
- . Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015)
- Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , 31-51 (2018).
- Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
- Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
- Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
- Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
- . The Chip Analysis Methylation Pipeline Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020)
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
- Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
- Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
- Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
- Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
- Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
- Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
- Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
- Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
- Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
- Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).
