DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

サンパウロ大学リベイラオン・プレト医科大学病院(HCRP-USP)の倫理委員会は、この研究を承認した(CAAE:14275319.7.0000.5440)。参加者は同意書に署名し、すべての手続きはヘルシンキ宣言に従って行われました。 1. 母集団とサンプリング BMI>30kg/m2の参加者を本試験のために募集する。本研究のために、混合集団19から18〜60歳の32人の女性が募集された。注:HCRP-USPでは、主に女性で肥満率の上昇が観察されました20。肥満の参加者は、BMI ≥30kg/m2(n = 15)で、HCRP-USPの代謝性疾患外来診療所から募集された。肥満のない参加者は、BMIが18.5kg/m2〜24.9kg/m2(n = 17)で、他の診療所から募集され、重篤な疾患を有さなかった。臨床データを表1に示す。 妊娠中の女性、授乳中の母親、喫煙者、アルコールを消費する女性を除外する。 2. 人体測定と体組成 200kgのデジタル人体測定スケールを使用して参加者の体重を測定します。靴や余分な衣服を必ず脱いでください。 0.5cmの目盛りが付いたスタディオメーターを使用して身長を評価します。参加者は,裸足で立ち,両足を合わせ,両脇に腕を組むように指示されました21。 電気生体インピーダンスを使用して脂肪量(FM)情報を収集します。12時間の絶食後、空の膀胱で評価する。参加者を仰臥位に置き、脚を離し、腕を体に触れずに平行にします。すべての金属製の付属品を取り外すよう参加者に指示する22。 0.1mmの目盛りが付いた伸縮性のない測定テープを使用して、腰囲(WC)を取得します。テープは、腰の骨のすぐ上、中腰の周りに水平に置かれました。測定は息を吐いた直後に行われました。疾病管理予防センター(CDC)によると、女性のトイレカットオフは88cm23です。 表1:人口特性 すべての変数はパラメトリック(p > 0.05、Shapiro Wilk)であり、p< 0.05が有意であると考えられる独立t検定を使用して差を評価しました。*p < 0.0001 です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. 生物材料の収集 前述のように、12時間の絶食後に末梢血を採取する24。 抗凝固剤(EDTAなど)を含む採取チューブに全血サンプル4mLを採取し、輸送のために氷上に保管する。 4. DNA抽出 血液を入れた各チューブを2,000 x g で10分間遠心分離する。約300μLのバフィーコート(白色中間相)を集める。 市販の器具( 材料表を参照)を用いて末梢血からDNAを抽出し、前述のように25。480 μLの超高純度H2O中のDNAを溶出する。 蛍光光度計を使用してDNA濃度と品質を評価します。完全性を、1%アガロースゲル分析を用いて評価した25。-80°Cの冷凍庫に保管してください。 5. メチル化分析前の準備 サンプルの最小 DNA 濃度 (開始に理想的な初期入力は 500 ng) であることを確認しますが、このステップでは希釈率がサンプル間で異なる場合があります。 マイクロアレイキット26に含まれていない試薬もあるため、別途購入してください27。 キットに手順中に使用されたすべての試薬が含まれているかどうかを確認します。彼らはかけがえのないものです。すべての試薬の有効期限を確認してください。キットに付属していない他の試薬および溶液も入手可能であることを確認してください(95%ホルムアミド/ 1mM EDTA、0.1N NaOH、無水エタノール、2-プロパノール)。警告: ホルムアミドは揮発性試薬です。製品が新鮮であれば、結果の品質を向上させることができます。ホルムアミドおよび無水エタノールの完全性と品質は、製造業者によって提案された染色プロセスに影響を与える可能性があるため、重要であると考えられています。選択されたアルコールは、分子生物学分析に特有の超高純度製品でなければならない。 マイクロアレイキットを入手したら、チップデコードマップ(DMAP)をダウンロードします。これらのファイルは、キットの出荷後24~48時間で製造元のWebサイトで入手でき、有効期限28日に除外されます。上記のファイルをダウンロードするには、次の手順に従います。 インターネットにアクセスできるコンピュータが利用可能であることを確認します。ソフトウェアデコードファイルクライアントを使用してダウンロードを実行します。 プログラムをインストールする前に、コンピュータにインスティテューションによって許可されたアウトバウンドおよびインバウンドアクセスがあることを確認してください。デコードファイルクライアントにはセキュリティ制限がありません。 BeadChip によるアクセスオプションを使用して、デコードファイルクライアントソフトウェアにログインします。このログインは、MyIlluminaユーザーIDとパスワードを使用して実行されます。このページの登録が必要です28。 デコードファイルクライアントにログインした後、ソフトウェアのホームページ28:バーコードのリストのそれぞれのフィールドに以下の情報を入力します。ボックスIDのリスト。発注書番号 (PO);と販売注文番号 (数字に続く文字を含めないでください)。 購入ボックスのバーコード番号に従ってダウンロードする DMAP を選択し、ダイアログボックスで保存先を指定して DMAP を保存します。 ボタンをクリックしてダウンロードを開始します。注:ダウンロードの最後に、ダウンロードしたフォルダが空でないことを確認し、実験を強度データファイル(IDATファイル)に変換する最後のステップで必要になるため、ファイルを安全に保存してください。有効期限が過ぎると、イルミナはDMAPデータをオンラインデータベースから削除することがあります。 6. DNAメチル化パイプライン 注:DNAメチル化実験は4日間に分かれています(図1)。製造元の推奨事項と仕様に従って、正確な結果を得てください。 1日目:亜硫酸水素塩処理 まず、500ngのゲノムDNAを変性させ、次いで変換試薬を加える。この手順を実行するには、バイサルファイトおよびマイクロアレイキット29の推奨事項に従ってください。 変性DNAを130μLのバイサルファイト変換試薬で製造元から提供された標準濃度で処理する。 チューブをサーモサイクラーで16サイクル、95°Cで30秒間、50°Cで1時間インキュベートします。サーモサイクラーを4°Cまで10分間ランプダウンします。 洗浄バッファーを100 μL加え、全速力で30秒間遠心分離して洗浄工程を行います。濃度はユーザーガイドには記載されておらず、メーカーは容量を標準化しています。注:この試薬はキットに付属しており、希釈または調製する必要はありません。 2日目:増幅 – メチル化アッセイ、手動プロトコル ハイブリダイゼーションオーブンを37°Cに予熱し、温度を平衡化させる。 バーコードラベルを0.8 mLマイクロプレートに貼り付けます。 増幅試薬(マルチサンプル増幅ミックス1、ランダムプライマーミックス、およびマルチサンプルアンプマスターミックス)を室温で解凍します(これらの試薬はキットに付属しており、希釈または調製する必要はありません)。次に、チューブの内容物全体が混合されるまで、少なくとも10倍の穏やかな反転を行います。 マルチサンプル増幅ミックス1(MA1)20 μLをプレートのウェルに分注します。 4 μL の DNA サンプルをバイサルファイト変換プレートから 0.8 mL プレート上の対応するウェルに移します。この時点で、プレートウェルに対応するラボ追跡フォームに元のDNAサンプルのIDを記録します。 マルチサンプル増幅ミックス1(MA1)およびDNAサンプルを含むプレートの各ウェルに4 μLの0.1 N NaOHを分注する。 プレートをプラスチックシールでシールします。 プレートを渦巻き、試薬とサンプルを1,600rpmで1分間混合する。室温で10分間インキュベートし、シールを慎重に取り外します。 68 μLのランダムプライマーミックス(RPM)をプレートの各ウェルにピペットします。75 μLのマルチサンプルアンプマスターミックス(MSM)をプレートの各ウェルにピペット(前の溶液を除去せずに)。プレートを覆うために新しいシールを使用してください。注:ウェルとプレートを結合し、正しく向きを変えるように注意してください。 密閉板を1,600rpmで1分間渦巻きます。ハイブリダイゼーションオーブン中で、37°Cで20〜24時間インキュベートする。 3日目:ハイブリダイゼーション – メチル化アッセイ、手動プロトコルブロックを37°Cに予熱する。 チューブの内容物を室温で解凍する。フラグメンテーション溶液(FMS)チューブを少なくとも10倍に慎重に静かに反転させて、内容物を完全に混合します。 プレートをハイブリダイゼーションオーブンから慎重に取り出します。プレートを280 x gでパルス遠心分離します。 次に、プレートからシールを外します。サンプルを含むプレートの各ウェルに、50 μLのフラグメンテーション溶液(FMS)を加え、プレートを再び密封します。プレートを 1,600 rpm で 1 分間渦巻きます。 プレートを280 x g で数秒間遠心分離します(パルス遠心分離を行います)。次いで、密閉板を加熱ブロック上に置き、37°Cで1時間反応させた。 実験を一時停止してプレートを凍結することに決めた場合は、室温で解凍し、280 x gで遠心分離 します。フリーズしていない場合は、この手順をスキップして手順 6.3.7 に進みます。 加熱ブロックを放置して37°Cに予熱する。 洗浄バッファーを放置して室温で解凍します。解凍したら、少なくとも10倍に反転させて内容物を混ぜます。 プレートからシールを外します。 サンプルを含むプレートの各ウェルに100 μLの沈殿溶液(PM1)を加える。 プレートをシールで再度シールします。 プレートを 1,600 rpm で 1 分間渦巻きます。 37°Cで5分間インキュベートする。 次いで、パルス遠心分離機に280 x g で1分間置く。メモ:次のステップのために遠心分離機を4°Cに設定してください。 プレートからシールを慎重に取り外して廃棄してください。 サンプルを含む各ウェルに300μLの2-プロパノール(100%)を加える。 新しいシールを使用して、細心の注意を払ってプレートをシールします。お皿を振らないように注意してください。 プレートを少なくとも10倍に反転させ、内容物全体を混合する。 4°Cで30分間インキュベートする。 3,000 x g で4°Cで20分間遠心分離する。メモ: ステップ 6.3.20 の最後に、遠心分離機プレートを直ちに取り外します。 プレートからシールを外して廃棄します。 プレートをすばやく反転させ、パッド上の液体を排出して上清を捨てます。次に、ペーパータオルの乾燥した部分にプレートを叩いて、液体を排出します。 1分間、またはすべてのウェルに液体がなくなるまで、数回しっかりとタップします。 プレートを反転させ、室温で1時間覆い隠します。注:井戸の底に青いペレットが見えると予想されます。 ハイブリダイゼーションオーブンを48°Cに予熱する。 ヒートブロックをオンにして予熱します。このプロセスには 20 分かかります。 再懸濁液を解凍し、ハイブリダイゼーションし、溶液を室温で洗浄する。少なくとも10倍に反転します。溶液中に塩が沈殿していないことを確認します。 46 μL の再懸濁液、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液 (RA1) をプレートの各ウェルに加えます。注:残りの試薬は、染色およびハイブリダイゼーションステップのために予約する必要があります。 プレートにシールを貼ります。プレートを覆うためにアルミニウムシールを使用してください。しっかりと保持して、シーリングを均等に実行します。 蒸発を避けるために、すべての井戸が安全に閉じられているかどうかを確認します。 新しく密封したプレートをハイブリダイゼーションオーブンに慎重に置き、48°Cで1時間インキュベートする。 プレートを 1,800 rpm で 1 分間渦巻きます。 280 x gのパルス遠心分離機。 プレートを95°Cで1時間ヒートブロックに移す。 ハイブリダイゼーション(Hyb)チャンバーを一緒に配置して準備します。400 μL の加湿バッファー (PB2) を Hyb チャンバーのリザーバーに分注します。すぐに蓋をしてください。 各サンプルをプレートからマイクロアレイのサンプルエントリ開口部にロードします。 マイクロアレイを含むHybチャンバーインサートをHybチャンバーにロードします。ハイブチャンバーを横方向に閉じて、ハイブチャンバーがずれないようにします。注:Hybチャンバーは、48°Cで少なくとも16時間、24時間以内でインキュベートする必要があります。 4日目:染色 – メチル化アッセイ、手動プロトコル染色溶液4を330mLの100%EtOHで再懸濁し、350mLの最終容量を得る。染色液4ボトルを激しく振って、完全に再懸濁することを確認します。室温で保管してください。注:染色溶液4は、2°C〜8°Cの温度で最大2週間保存することができます。 ハイブリダイゼーションオーブンからチャンバーを取り出し、ベンチで30分間冷却してから開く。 Hyb チャンバーが冷却されている間、2 つの洗浄容器に洗浄バッファー (洗浄容器あたり 200 mL) を充填します。各容器に「洗浄バッファー」(PB1およびPB2)のラベルを付けることを忘れないでください。 マイクロアレイアライメントアクセサリーに150 mLのウォッシュバッファーを充填します。 プラスチック製のスペーサーを分離し、必要に応じてガラスを清掃します。 マイクロアレイスライドを洗浄するには、ワイヤループをグリッドに取り付け、滴下装置を200mLの洗浄バッファーで容器に浸漬し、合計10倍にします。 ハイブリダイゼーションチャンバーからすべてのインサートを取り外し、各アレイをインサートから取り外します。シールを外します。メモ: 取り外し中は、露出したマトリックスに触れないでください。 マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り外す際は、何もこぼさないように注意してください。 マイクロアレイを洗浄バッファー(PB1)溶液でゆっくりと軽く洗浄し、上下に10倍に動かします。新鮮なPB1溶液に移動し、溶液中でマイクロアレイを10xずつゆっくりと上下に動かして洗浄を行う。 マイクロアレイを容器から取り出し、残留物がないことを確認します。 各マイクロアレイの上部にある透明なスペーサーを使用し、スペーサーを対応する位置に導きます。メモ: 透明なスペーサーのみを使用し、白いスペーサーは使用しないでください。 位置合わせバーを位置合わせアクセサリの上に置きます。 透明なスペーサーの上部にガラスのバックプレートを置きます。マイクロアレイ全体を覆うように注意してください。次に、フローチャンバに金属クランプを取り付けます。必要に応じて、はさみを使用してフローチャンバースペーサーの端をトリミングします。 直ちにddH2Oを使用してハイブリダイゼーションチャンバーリザーバを洗浄し、小さな洗浄ブラシでスクラブします。加湿バッファーを貯水池に残さないでください。 マイクロアレイの拡張と染色を担当する次のステップに進みます。メモ:すべてのフローチャンバを実験室ベンチに水平に取り付けたままにしておきます。染色ステップ全体の準備ができたら、それらを再処理してください。再懸濁液、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液を20°C〜25°Cの温度に加熱する。 溶液中に結晶が見えなくなるまで穏やかに混合する。 試薬をラックに順番に置きます。凍結している場合は、室温で放置してから、少なくとも10倍に反転させて溶液を混合します。 水循環器を適切なレベルまで満たします。 ポンプの電源を入れ、温度を44°Cに設定します。 チャンバー・ラックに取り付けられている気泡をすべて取り除きます。 温度プローブを使用してチャンバーラックでテストを実行します。すべての試験場所は、44 °C ~ 0.5 °C の間±必要があります。メモ: 次の手順は、中断することなく実行する必要があります。 ラックの温度が 44 °C に達したら、各アセンブリーをフロー・チャンバーに素早く配置します。注:次の手順では、すべての試薬を背面ガラスプレートにピペットでピペットします。 ピペット150 μLの再懸濁、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液(RA1)。その後、30分間インキュベートする。この手順を合計 5 回繰り返します。 染色液1(XC1)450 μLをピペットに入れ、10分間インキュベートした。 450 μLの染色液2(XC2)をピペットに入れ、10分間インキュベートした。 200 μLの2色エクステンションマスターミックス(TEM)をピペットに入れ、15分間インキュベートします。 95%ホルムアミド/1 mM EDTAのピペット450 μLを1分間インキュベートします。 5分間インキュベートする。 チャンバーラックの温度を32°C(スーペリア2色マスターミックスに表示)まで下げます。 450 μLの染色液3(XC3)をピペットに入れ、1分間インキュベートします。 チャンバー内のラックが正しい温度に達するまで待ちます。メモ:カラーリング処理の直後にマイクロアレイ画像を読み取るには、この段階でスキャナの電源を入れてください。 次に、250 μL のスーペリア 2 色マスター ミックス (STM) を分注し、その後 10 分間インキュベーションします。 次いで、450μLの染色液3(XC3)を分注し、続いて1分間インキュベートした。1xを繰り返します。 5分間待ってから、250μLのアンチステイン2カラーマスターミックス(ATM)を加え、10分間インキュベートします。 次に、250 μL のスーペリア 2 色マスター ミックス (STM) を分注し、その後 10 分間インキュベーションします。 次いで、450μLの染色液3(XC3)を分注し、続いて1分間インキュベートした。1xを繰り返します。 5分間待ちます。 250 μL のアンチステイン 2 カラーマスターミックス (ATM) を加え、10 分間インキュベートします。 450 μLのステインマイクロアレイ溶液3(XC3)を加え、1分間インキュベートした後、再度繰り返します。 5分間待ちます。メモ: 次の繰り返し方式を実行します: ステップ 6.4.34、ステップ 6.4.35。ステップ6.4.36.;ステップ 6.4.37、6.4.38、およびステップ 6.4.39.;ステップ 6.4.34、ステップ 6.4.35、およびステップ 6.4.36。 次に、フローチャンバをラックから直ちに取り外し、実験室ベンチに水平に慎重に置きます。温度が周囲であることを確認します。 6.4.41.各マイクロアレイの洗浄液(PB1)310mLを洗浄容器に入れる。 金属製のクランプとガラス、最後にマイクロアレイを取り外します。 マイクロアレイを染色ラックの上に置き、10x PB1溶液を入れた洗浄容器に入れます。バーコードが誰からも遠ざかり、すべてのマイクロアレイが水没していることを確認します。 上下の動きを10倍にしてゆっくりと軽く動かします。マイクロアレイは、再び水没する前に溶液から完全に除去されるべきである。その後、5分間水没したままにします。 染色液4(XC4)試薬を激しく振とうし、完全な再懸濁を確実にする。310mLのXC4を洗浄容器に入れる。注:溶液を洗浄容器に10分以上入れないでください。 染色スタンドをXC4で他の容器に軽く動かします。 上下の動きを10倍にしてゆっくりと軽く動かします。マイクロアレイが再び水没する前に、溶液から完全に取り外されていることを確認してください。 その後、マイクロアレイを5分間沈めたままにします。 染色された目玉を溶液から取り出し、バーコードを上に向けてチューブホルダーに入れます。 ロック鉗子を使用してマイクロアレイを慎重に取り外し、棚に置いて乾燥させます。 真空デシケーターを使用して、675 mm Hg(0.9 bar)で50〜55分間乾燥させます。 EtOHを使用して各マイクロアレイの背面をクリーニングします。警告: ストライプには触れないでください。また、EtOH がストライプに滴り落ちないようにしてください。 マイクロアレイのイメージ化に進みます。 マイクロアレイを室温で保管ボックスに慎重に保管してください。メモ: マイクロアレイ画像は 72 時間以内に撮影する必要があります。 7. バイオインフォマティクス解析 注:マイクロアレイの種類のいくつかの属性を変更する必要があります(例えば、アレイタイプ= “450k”はアレイタイプ= “EPIC”に置き換える必要があります)。ChAMPパイプラインの著者は、パッケージのバイオコンダクターページでアレイを分析するために変更する必要があるすべてのフィールドを詳細に説明しています30。 サンプルシート IDATファイルをコンピュータに転送して、バイオインフォマティクス解析を続行します31。データ解析31を実行するためのサンプルシートを作成する。メモ: このスプレッドシートファイルには 3 つの列が不可欠です。1つ目はSample_nameです。この列には、サンプルを識別するために使用される名前またはコードを含める必要があります。2つ目はSentrix_positionです。この列はサンプルの対応するR01C01を配置し、R01はチップ行を担当し、列はC01と呼ばれます。3番目の必須列はSentrix_IDであり、マイクロアレイを識別する番号を受け取る役割を担います。必ず正しい数字を入れてください。サンプルシートに他の情報を変数値として追加することができます。なお、本実験には、金属分析からのデータが含まれていた。 チャンプパイプライン RStudio (V.4.0.2) をコンピューターにインストールして、分析を実行します30。メモ: コンピュータに 8 G 以上の RAM が搭載されていることを確認します。データ分析は、より少ない量のRAMで苦労したりクラッシュしたりします。 インストール後、RStudioを開き、それぞれのコマンドラインを使用してChAMPバイオコンダクターパッケージ30 をインストールします( 補足資料1を参照)。メモ: インストールの最後にエラーが発生した場合は、必要な ChAMP ライブラリを 1 つずつ手動でインストールします26。 次に、生データをインポートし、分析を実行します。 補足資料1を参照してください。champ.load() は生データをインポートし、検出率の低い pval を持つプローブ、マルチヒットサイト、非 CG プローブ、SNP に近い CpG サイト、および性染色体に位置する CpG を除くフィルタリング処理を行います。champ.impute() はデフォルトとして KNN 代入を実行します。チャンプ。QC は、データ品質グラフ(例えば、密度プロットグラフ)を取得する。チャンプ。SVD は、サンプル シートに用意されたメタデータに基づいてバッチ効果を評価します。champ.refbase() は、セル・タイプの推定と訂正を実行します。チャンプ。DMP( ) は、 補足資料1に示すように、差次メチル化された位置と脂肪量などの形質関連を取得して、グループ間のDNAメチル化を確認し、パラメータを変更します。 エンリッチメント (文字列 DB)注:機能的富化は、一連の遺伝子の生物学的機能を推測するために使用される。 文字列内のデータを強化するには、情報付加して入力として使用するターゲットのリストを選択します。https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form=multiple_identifiers 生物の場合は、ホモサピエンスを選択し、検索ボタンを押します。 エンリッチメント内を移動するには、[分析] ボタンをクリックします。 GEOの提出 NCBIのGEOのようなパブリックリポジトリにデータをデポジットします。このためには、提出者アカウントに登録してください。注: 実験全体と個々のサンプルの説明情報とプロトコルを含むメタデータ シートをダウンロードして、GEO の提出 (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) を完了します。GEOアーカイブの提出は、任意のスプレッドシートソフトウェアで作成できます。次に、すべてのライブラリのセルレンジャーカウントスクリプトから生成された生データファイルをディレクトリに追加します。IDAT および関連ファイルまたはマトリックス ワークシートには、正規化されていないデータが含まれています。3 番目のフォルダーは、処理されたデータ ファイルです。マトリックステーブルは、行およびサンプル間で比較可能な最終的な正規化された値を含むスプレッドシートであり、好ましくは、付随する原稿に記述されているように処理される。 すべてのライブラリーのセル・レンジャー・カウント・スクリプトから生成された処理済みデータ・ファイルをディレクトリーに入れます。GEO 送信者の FTP サーバー資格情報を使用して、3 つのコンポーネントすべてを含むディレクトリを転送します。