הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות
Summary
המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.
Abstract
השמנת יתר קשורה ישירות לאורח החיים ונקשרה לשינויים במתילציה בדנ”א שעלולים לגרום לשינויים בתהליכי אחסון אדיפוגנזה ושומנים התורמים להתפתחות המחלה. אנו מדגימים פרוטוקול מלא מבחירה לניתוח נתונים אפיגנטיים של חולים עם ובלי השמנת יתר. כל השלבים מהפרוטוקול נבדקו ואומתו במחקר פיילוט. 32 נשים השתתפו במחקר, שבו 15 אנשים סווגו עם השמנת יתר על פי מדד מסת הגוף (BMI) (45.1 ± 5.4 ק”ג / מ”ר); ו -17 אנשים סווגו ללא השמנת יתר על פי BMI (22.6 ± 1.8 ק”ג / מ”ר). בקבוצה עם השמנת יתר, 564 אתרי CpG הקשורים מסת שומן זוהו על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית. אתרי CpG היו באזורי האמרגן. הניתוח הדיפרנציאלי מצא 470 CpGs hypomethylated ו 94 אתרים hypermethylated אצל אנשים עם השמנת יתר. המסלולים המועשרים ההיפותרתיים ביותר היו ב – RUNX, איתות WNT , ותגובה להיפוקסיה. המסלולים hypermethylated היו קשורים הפרשת אינסולין, איתות גלוקגון, ו Ca2 +. אנו מסיקים כי הפרוטוקול זיהה ביעילות דפוסי מתילציה DNA ומתילציה DNA הקשורים לתכונות. דפוסים אלה יכולים להיות קשורים עם ביטוי גנים שונה, המשפיעים על אדיפוגנזה ואחסון שומנים בדם. התוצאות שלנו אישרו שאורח חיים שמנה יכול לקדם שינויים אפיגנטיים בדנ”א האנושי.
Introduction
טכנולוגיות omics בקנה מידה גדול שימשו יותר ויותר במחקרים של מחלות כרוניות. מאפיין מעניין של שיטות אלה הוא הזמינות של כמות גדולה של נתונים שנוצרו לקהילה המדעית. לכן, עלתה דרישה לתקנן את הפרוטוקולים כדי לאפשר השוואה טכנית בין מחקרים. המחקר הנוכחי מציע סטנדרטיזציה של פרוטוקול כדי להשיג ולנתח נתוני מתילציה DNA, באמצעות מחקר פיילוט כדוגמה ישימה.
הוצאה שלילית על אנרגיה שולטת באורח החיים האנושי המודרני, מה שמוביל להצטברות מופרזת של רקמת שומן, וכתוצאה מכך להתפתחות של השמנת יתר¹. גורמים רבים הגבירו את שיעורי ההשמנה, כגון בישיבה, דיאטות עתירות קלוריות ושגרות מלחיצות. ארגון הבריאות העולמי (WHO) העריך כי 1.9 מיליארד מבוגרים סבלו מהשמנת יתר בשנת 2016, כלומר יותר מ -20% מאוכלוסיית העולם יש מעל 30 ק”ג / מ “ר2 BMI2. העדכון האחרון של 2018 גילה כי השכיחות של השמנת יתר בארצות הברית של אמריקה (ארה”ב) היה גבוה מ 42%3.
אפיגנטיקה היא הסתגלות מבנית של אזורים כרומוזומליים לרישום, איתות או הנצחת מצבי פעילות שהשתנו4. מתילציה DNA הוא שינוי כימי הפיך באתרי ציטוזין-גואנוסין dinucleotides (אתרי CpG), יצירת 5-מתילציטוצין-pG (5mCpG). זה יכול לווסת את ביטוי הגנים על ידי ויסות הגישה של מכונות שעתוק ל- DNA5,6,7,8. בהקשר זה, זה חיוני כדי להבין אילו אתרי CpG קשורים עם תכונות הקשורות להשמנת יתר9. גורמים רבים יכולים לתמוך או למנוע מתילציה DNA ספציפית לאתר. אנזימים נחוצים לתהליך זה, כגון מתיל-טרנספראזס DNA10 (DNTMs) ו-10-11 טרנסלוקציות (TETs), יכולים לקדם מתילציה או דמתילציה של דנ”א תחת חשיפות סביבתיות11.
בהתחשב בהתעניינות הגוברת במחקרי מתילציה DNA בשנים האחרונות, בחירת אסטרטגיית הניתוח המתאימה ביותר כדי לענות במדויק על כל שאלה הייתה דאגה חיונית של חוקרים 12,13,14. מערך מתילציה DNA 450K הוא השיטה הפופולרית ביותר, בשימוש ביותר מ 360 פרסומים14 לקביעת פרופיל מתילציה DNA. זה יכול לקבוע את המתילציה של עד 485,000 CpGs הממוקם ב 99% של הגנים הידועים15. עם זאת, מערך זה הופסק והוחלף ב- EPIC, המכסה 850,000 אתרי CpG. ניתן להחיל את הפרוטוקול הנוכחי הן עבור 450K והן עבור EPIC16,17,18.
הפרוטוקול מוצג צעד אחר צעד באיור 1 וכולל את השלבים הבאים: בחירת אוכלוסיה, דגימה, הכנת ניסויים, צינור מתילציה של דנ”א וניתוח ביואינפורמטיקה. מחקר פיילוט המבוצע במעבדה שלנו מוצג כאן כדי להמחיש את שלבי הפרוטוקול המוצע.
איור 1: סכמטי של הפרוטוקול המוצג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכי מתילציה של דנ”א הם השיטות הנפוצות ביותר לגישה למתילציה של דנ”א בשל יחס העלות-תועלת שלהם14. המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול מפורט באמצעות פלטפורמת microarray זמינה מסחרית כדי להעריך מתילציה DNA במחקר פיילוט שבוצע בקבוצה ברזילאית. התוצאות שהתקבלו ממחקר הפיילוט אישרו את האפקטיביות של הפרוטוקול. איור 3 מציג את השוואת המדגם ואת ההמרה המלאה של ביסולפיט32.
כשלב בקרת איכות, אלגוריתם ChAMP המליץ על אי הכללה של אתרי CpGs במהלך תהליך הסינון. המטרה של אי הכללת בדיקות היא לשפר את ניתוח הנתונים ולחסל הטיה. CpGs באיכות נמוכה (p-ערכים נמוכים מ 0.05) הוסרו כדי למנוע רעש ניסיוני בערכת הנתונים. המטרות נותרו מועברות בניתוח עלילת הצפיפות. Zhou33 תיאר את החשיבות של סינון CpGs ליד SNPs כדי למנוע אי התאמות, פרשנות שגויה של מתילציה של ציטוזין פולימורפי, וגרימת צבע מתג מסוג I בדיקה עיצוב34. כמו כן, כמו כרומוזומי XY מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי הטבעה, הייס ו Just35 חיזק את החשיבות של סינון בדיקות אלה כי, אצל נקבות, הבעיות עם הכלאה עשויות להיות גורמים מבלבלים35.
תאריך התפוגה של DMAPs, תאריך הפתיחה של פורממיד, האיכות האנליטית של האתנול המוחלט, וספירת הלאוקוציטים הכוללת נחשבים לשלבים קריטיים בפרוטוקול.
יתר על כן, על פי התצפיות שלנו, הערכת סוג התא חיונית בביצוע ניתוח הביו-אינפורמטיקה. שיטת האוסמן מבצעת את הערכת סוג התא כמתואר במחקרו של טיאן30. שיטה זו מבוססת על 473 אתרי CpG ספציפיים שיכולים לחזות את האחוזים של סוגי התאים החשובים ביותר, כגון גרנולוציטים, מונוציטים, תאי B ותאי T36. השתמשנו בפונקציה המומלצת “myRefbase” מחבילת ChAMP. לאחר ההערכה, אלגוריתם ChAMP מתאים את ערכי הביתא ומבטל הטיה זו מקבוצת הנתונים. צעד זה חיוני במחקרים המתמקדים בהשמנת יתר מכיוון שלאוכלוסייה זו יש הבדל ניכר בתאי הדם הלבנים בשל מצבם הדלקתי הכרוני.
שינינו רק את מפת המכסה המקורית עבור חותם ה- PCR המשותף לגבי שינוי שיטה ופתרון בעיות. לאחר כל תהליך צנטריפוגה, החותם השתנה עבור אחד חדש. לא יכולנו להשתמש באיטום החום הסטנדרטי והתאמנו אותו באמצעות רדיד אלומיניום סביב הצלחת.
למרות בדיקות מסחריות נחשבו תקן זהב למחקרים אפיגנטיים, מגבלה אחת של הפרוטוקול יכול להיות הספציפיות של ריאגנטים וציוד ממותג ייחודי37,38,38,39,40. מגבלה נוספת היא היעדר אינדיקטורים המאפשרים זיהוי של ההתקדמות הנכונה של הניסוי41.
התקינה של הפרוטוקול הנוכחי מייצגת מדריך נהדר למחקר אפיגנטי, הפחתת טעויות אנוש במהלך התהליך ומאפשר ניתוח נתונים מוצלח והשוואה בין מחקרים שונים.
על פי התוצאות שלנו, ניסויי מתילציה DNA מתאימים למחקרים השוואת אנשים עם וללא השמנת יתר43. כמו כן, ניתוח הביו-אינפורמטיקה המוצע סיפק נתונים באיכות גבוהה וניתן היה לשקול אותו במחקרים בקנה מידה גדול.
באמצעות ניתוח SVD, זיהינו כי התכונות הקשורות להשמנת יתר (BMI, WC, ו- FM) השפיעו על השונות בנתוני מתילציה DNA. כתוצאה משמעותית, הערכת סוג התא מצביעה על כך שתאי הרג הטבעיים (NK) ותאי B היו גבוהים יותר אצל נשים עם השמנת יתר מאשר אצל נשים ללא השמנת יתר (איור 5). ספירות גבוהות יותר של תאים אלה יכול להיות מוסבר על ידי מצב דלקתי בדרגה נמוכה של אנשים אלה44. ראינו כי חולים עם השמנת יתר יש hypo-ו hypermethylated CPGs באזורי מקדם של גנים הקשורים מסת שומן. רוב האתרים היו hypomethylated, אשר יכול להיות קשור לעלייה הטבעית של מינים חמצן תגובתי (ROS) רמות אצל אנשים אלה. מצב עקה חמצוני זה עשוי לקדם את ההפרעה גואנין באתר dinucleotide, יצירת 8-הידרוקסי-2′-deoxyguanosine (8-OHdG), וכתוצאה מכך 5mCp-8-OHdG dinucleotide אתר, גרימת גיוס אנזימי TET. כל האירועים האלה יכולים להיות אחראים לקידום hypomethylation DNA היפרמתילציה על ידי מנגנונים שונים של פעולה45.
בנוסף, נראה כי שיעור אדיפוגנזה עולה אצל אנשים עם השמנת יתר, עם כ -10% מהתאים החדשים לתאים ישנים46,47. תרומות אפיגנטיות, המדגישות את הסביבה ההשמנה, יכולות לשנות את שיעורי ההתפשטות וההבחנה של התאים, לטובת התפתחות מסת השומן48. שינויים אפיגנטיים יכולים גם להשפיע על תוכניות אדיפוגניות, להקל או להגביל את התפתחותם. גורמי שעתוק ראשוניים (PPARγ או C / EBPα) או הרכבה של מתחמי מולטי-פרוטאין, הממוקמים באזורי מקדם במורד הזרם המופעלים על ידי הכללה או אי-הכללה של אנזימים לשינוי אפיגנטי, מווסתים את ביטוי הגנים באמצעות היפר-או היפומתילציה45. מסלול PPARγ תואר בעבר כדי לשנות את מסלול WNT, אשר היו גנים מועשרים במחקר זה. למרות שזה עדיין לא ידוע איך איתות WNT מתרחשת במהלך אדיפוגנזה, מחקרים אחרונים דיווחו כי זה יכול להיות תפקידים חיוניים בחילוף החומרים adipocyte, במיוחד תחת תנאים שמנים49.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליואן טיאן, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) על היותו זמין לענות על כל הספקות לגבי חבילת ChAMP. אנו מודים גם לגילהרמה טלס, Msc. על תרומתו הן לנושאים הטכניים והן לנושאים המדעיים ממאמר זה; הוא עשה שיקולים חשובים לגבי אפיגנטיקה וטכניקות לכידת וידאו ועיצוב (guilherme.telles@usp.br). מימון חומרים מתכלים: קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP) (#2018/24069-3) והמועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq: #408292/2018-0). מימון אישי: (FAPESP: #2014/16740-6) ותוכנית מצוינות אקדמית מהתיאום לפיתוח סגל ההשכלה הגבוהה (CAPES:88882.180020/2018-01). הנתונים יהיו זמינים לציבור ובחופשיות ללא הגבלה. התאמת כתובת ל- NYN (דואר אלקטרוני: nataliayumi@usp.br) או CBN (דואר אלקטרוני: carla@fmrp.usp.br).
Materials
| Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
| Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
| Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
| EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
| HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
| Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
| MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
| MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
| NaOH | F. MAIA | 114700 | |
| PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
| PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
| 2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
| RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
| RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
| STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
| TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
| Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
| XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
| XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
| XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
| XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |
References
- Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
- . Obesity Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017)
- Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021)
- Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
- Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
- Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
- Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
- Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
- Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
- Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
- Yong, W. -. S., Hsu, F. -. M., Chen, P. -. Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
- Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
- Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
- Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
- Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
- Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
- Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
- Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
- Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020)
- Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
- Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
- . Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015)
- Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , 31-51 (2018).
- Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
- Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
- Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
- Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
- . The Chip Analysis Methylation Pipeline Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020)
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
- Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
- Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
- Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
- Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
- Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
- Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
- Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
- Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
- Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
- Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
- Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
- Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).
