Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien
Summary
Die vorliegende Studie beschreibt den Workflow zur Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten, die durch Microarray-Technologien erhalten werden. Das Protokoll veranschaulicht die Schritte von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse. Alle Verfahren werden detailliert beschrieben, und das Video zeigt die wesentlichen Schritte.
Abstract
Fettleibigkeit ist direkt mit dem Lebensstil verbunden und wurde mit DNA-Methylierungsveränderungen in Verbindung gebracht, die Veränderungen in der Adipogenese und den Lipidspeicherprozessen verursachen können, die zur Entwicklung der Krankheit beitragen. Wir demonstrieren ein vollständiges Protokoll von der Selektion bis zur epigenetischen Datenanalyse von Patienten mit und ohne Adipositas. Alle Schritte aus dem Protokoll wurden in einer Pilotstudie getestet und validiert. 32 Frauen nahmen an der Studie teil, in der 15 Personen mit Adipositas nach dem Body-Mass-Index (BMI) klassifiziert wurden (45,1 ± 5,4 kg/m2); und 17 Personen wurden ohne Adipositas nach BMI klassifiziert (22,6 ± 1,8 kg/m2). In der Gruppe mit Adipositas wurden 564 CpG-Stellen im Zusammenhang mit der Fettmasse durch lineare Regressionsanalyse identifiziert. Die CpG-Standorte befanden sich in den Promotorregionen. Die Differentialanalyse ergab 470 CpGs hypomethylierte und 94 hypermethylierte Stellen bei Personen mit Adipositas. Die am stärksten hypomethylierten angereicherten Wege waren in der RUNX, WNT-Signalgebung und Reaktion auf Hypoxie. Die hypermethylierten Signalwege waren mit Insulinsekretion, Glucagon-Signalisierung und Ca2 + verbunden. Wir kommen zu dem Schluss, dass das Protokoll DNA-Methylierungsmuster und merkmalsbezogene DNA-Methylierung effektiv identifiziert hat. Diese Muster könnten mit einer veränderten Genexpression in Verbindung gebracht werden, die die Adipogenese und die Lipidspeicherung beeinflusst. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass ein fettleibiger Lebensstil epigenetische Veränderungen in der menschlichen DNA fördern könnte.
Introduction
Groß angelegte Omics-Technologien werden zunehmend in Studien zu chronischen Krankheiten eingesetzt. Ein interessantes Merkmal dieser Methoden ist die Verfügbarkeit einer großen Menge an generierten Daten für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Daher ist eine Forderung nach Standardisierung der Protokolle entstanden, um einen technischen Vergleich zwischen Studien zu ermöglichen. Die vorliegende Studie schlägt die Standardisierung eines Protokolls zur Gewinnung und Analyse von DNA-Methylierungsdaten vor, wobei eine Pilotstudie als Anwendungsbeispiel verwendet wird.
Der negative Energieverbrauch überwiegt in der modernen menschlichen Lebensweise, was zu einer übermäßigen Ansammlung von Fettgewebe und folglich zur Entwicklung von Fettleibigkeit führt¹. Viele Faktoren haben die Fettleibigkeitsraten erhöht, wie Sesshaftigkeit, kalorienreiche Diäten und stressige Routinen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzte, dass 1,9 Milliarden Erwachsene im Jahr 2016 fettleibig waren, was bedeutet, dass mehr als 20% der Weltbevölkerung über 30 kg / m2 BMI2 haben. Das jüngste Update von 2018 ergab, dass die Prävalenz von Fettleibigkeit in den Vereinigten Staaten von Amerika (USA) höher als 42% war3.
Epigenetik ist die strukturelle Anpassung chromosomaler Regionen, um veränderte Aktivitätszustände zu registrieren, zu signalisieren oder aufrechtzuerhalten4. Die DNA-Methylierung ist eine reversible chemische Veränderung in den Cytosin-Guanosin-Dinukleotid-Stellen (CpG-Stellen), die 5-Methylcytosin-pG (5mCpG) bildet. Es kann die Genexpression modulieren, indem es den Zugang der Transkriptionsmaschinerie zur DNA5,6,7,8 reguliert. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu verstehen, welche CpG-Sites mit Adipositas-bezogenen Merkmalen assoziiert sind9. Viele Faktoren können die ortsspezifische DNA-Methylierung unterstützen oder verhindern. Notwendige Enzyme für diesen Prozess, wie DNA-Methyltransferasen10 (DNTMs) und Ten-Eleven-Translokationen (TETs), können die DNA-Methylierung oder Demethylierung unter Umwelteinflüssen fördern11.
Angesichts des wachsenden Interesses an DNA-Methylierungsstudien in den letzten Jahren war die Wahl der am besten geeigneten Analysestrategie zur präzisen Beantwortung jeder Frage ein wesentliches Anliegen der Forscher12,13,14. Das 450K DNA-Methylierungsarray ist die beliebteste Methode, die in mehr als 360 Publikationen14 zur Bestimmung des DNA-Methylierungsprofils verwendet wird. Es kann die Methylierung von bis zu 485.000 CpGs in 99% der bekannten Gene bestimmen15. Dieses Array wurde jedoch eingestellt und durch das EPIC ersetzt, das 850.000 CpG-Standorte abdeckt. Das vorliegende Protokoll kann sowohl für 450K als auch für EPIC16,17,18 angewendet werden.
Das Protokoll wird Schritt für Schritt in Abbildung 1 dargestellt und umfasst die folgenden Schritte: Populationsauswahl, Probenahme, Versuchsvorbereitung, DNA-Methylierungspipeline und bioinformatische Analyse. Eine in unserem Labor durchgeführte Pilotstudie wird hier demonstriert, um die Schritte des vorgeschlagenen Protokolls zu veranschaulichen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des vorgestellten Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-Methylierungsarrays sind aufgrund ihres Kosten-Nutzen-Verhältnisses die am häufigsten verwendeten Methoden für den Zugang zur DNA-Methylierung14. Die vorliegende Studie beschrieb ein detailliertes Protokoll unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Microarray-Plattform zur Bewertung der DNA-Methylierung in einer Pilotstudie, die in einer brasilianischen Kohorte durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse der Pilotstudie bestätigten die Wirksamkeit des Protokolls. Abbildung 3 zeigt die Vergleichbarkeit der Stichprobe und die vollständige Bisulfit-Konvertierung32.
Als Qualitätskontrollschritt empfahl der ChAMP-Algorithmus den Ausschluss von CpGs-Standorten während des Filterprozesses. Ziel des Ausschlusses von Sonden ist es, die Datenanalyse zu verbessern und Bias zu eliminieren. Die minderwertigen CpGs (p-Werte unter 0,05) wurden entfernt, um experimentelles Rauschen im Datensatz zu eliminieren. Die Ziele blieben in der Dichtediagrammanalyse erhalten. Zhou33 beschrieb die Bedeutung der Filterung von CpGs in der Nähe von SNPs, um Diskrepanzen zu vermeiden, eine Fehlinterpretation der Methylierung polymorpher Cytosine und die Verursachung von Schaltfarbe des Typ-I-Sondendesigns34. Da XY-Chromosomen durch Prägung unterschiedlich beeinflusst werden, haben Heiss und Just35 die Bedeutung der Filterung dieser Sonden verstärkt, da bei Frauen die Probleme mit der Hybridisierung Störfaktoren sein können35.
Das Verfallsdatum der DMAPs, das Eröffnungsdatum des Formamids, die analytische Qualität des absoluten Ethanols und die Gesamtleukozytenzahl gelten als kritische Schritte im Protokoll.
Darüber hinaus ist nach unseren Beobachtungen die Zelltypschätzung für die Durchführung der bioinformatischen Analyse unerlässlich. Die Houseman-Methode führt die Zelltypschätzung durch, wie in Tians Studie30 beschrieben. Diese Methode basiert auf 473 spezifischen CpG-Standorten, die die Prozentsätze der wichtigsten Zelltypen wie Granulozyten, Monozyten, B-Zellen und T-Zellen vorhersagen können36. Wir haben die empfohlene Funktion “myRefbase” aus dem ChAMP-Paket verwendet. Nach der Schätzung passt der ChAMP-Algorithmus die Beta-Werte an und eliminiert diese Verzerrung aus dem Datensatz. Dieser Schritt ist in Studien, die sich auf Fettleibigkeit konzentrieren, von entscheidender Bedeutung, da diese Population aufgrund ihres chronischen Entzündungszustands einen erheblichen Unterschied in den weißen Blutkörperchen aufweist.
Wir haben nur die ursprüngliche Kappenkarte für das gängige PCR-Siegel in Bezug auf Methodenmodifikation und Fehlerbehebung geändert. Nach jedem Zentrifugationsprozess wurde die Dichtung gegen eine neue ausgetauscht. Wir konnten die Standard-Heißsiegelung nicht verwenden und passten sie mit Aluminiumfolie um die Platte an.
Obwohl kommerzielle Assays als Goldstandard für epigenetische Studien angesehen wurden, könnte eine Einschränkung des Protokolls die Spezifität der Reagenzien und Geräte einer einzigartigen Marke sein37,38,39,40. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen von Indikatoren, die es ermöglichen, den korrekten Fortschritt des Experiments zu identifizieren41.
Die Standardisierung des vorliegenden Protokolls stellt einen großartigen Leitfaden für die epigenetische Forschung dar, reduziert menschliche Fehler während des Prozesses und ermöglicht eine erfolgreiche Datenanalyse und Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien.
Nach unseren Ergebnissen eignen sich DNA-Methylierungsexperimente für Studien, die Personen mit und ohne Adipositas vergleichen43. Auch die vorgeschlagene bioinformatische Analyse lieferte qualitativ hochwertige Daten und konnte in groß angelegten Studien berücksichtigt werden.
Mit Hilfe der SVD-Analyse identifizierten wir, dass die Adipositas-bezogenen Merkmale (BMI, WC und FM) die Variabilität in DNA-Methylierungsdaten beeinflussten. Als signifikantes Ergebnis zeigt die Zelltypschätzung, dass sowohl natürliche Killerzellen (NK) als auch B-Zellen bei Frauen mit Adipositas höher waren als bei Frauen ohne Adipositas (Abbildung 5). Die höhere Anzahl dieser Zellen könnte durch den minderwertigen Entzündungszustand dieser Individuen erklärt werden44. Wir beobachteten, dass Patienten mit Adipositas hypo- und hypermethylierte CpGs in Promotorregionen von Genen haben, die mit der Fettmasse assoziiert sind. Die meisten Stellen waren hypomethyliert, was mit dem natürlichen Anstieg der Spiegel der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei diesen Individuen zusammenhängen könnte. Dieser oxidative Stresszustand kann Guaninperturbance an der Dinukleotidstelle fördern, 8-Hydroxy-2′-desoxyguanosin (8-OHdG) bilden, was zu einer 5mCp-8-OHdG-Dinukleotidstelle führt und die Rekrutierung von TET-Enzymen verursacht. All diese Ereignisse könnten für die Förderung der DNA-Hypomethylierung und Hypermethylierung durch verschiedene Wirkmechanismen verantwortlich sein45.
Darüber hinaus scheint die Rate der Adipogenese bei Personen mit Fettleibigkeit zu steigen, wobei etwa 10% der neuen Zellen zu alten Zellen werden46,47. Epigenetische Beiträge, die die fettleibige Umgebung betonen, können die Proliferations- und Differenzierungsraten der Zellen verändern und die Entwicklung der Fettmasse begünstigen48. Epigenetische Veränderungen können auch adipogene Programme beeinflussen und ihre Entwicklung erleichtern oder einschränken. Primäre Transkriptionsfaktoren (PPARγ oder C / EBPα) oder die Assemblierung von Multiproteinkomplexen, die in nachgeschalteten Promotorregionen positioniert sind, die durch Ein- oder Ausschließen epigenetisch modifizierender Enzyme betrieben werden, regulieren die Genexpression durch Hyper- oder Hypomethylierung45. Der PPARγ-Signalweg wurde zuvor beschrieben, um den WNT-Signalweg zu verändern, der in dieser Studie Gene angereichert hatte. Obwohl noch nicht bekannt ist, wie die WNT-Signalgebung während der Adipogenese auftritt, haben neuere Studien berichtet, dass sie eine wesentliche Rolle im Adipozytenstoffwechsel spielen könnte, insbesondere unter adikogenen Bedingungen49.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) dafür danken, dass er zur Verfügung stand, um alle Zweifel am ChAMP-Paket zu beantworten. Wir danken auch Guilherme Telles, Msc. für seinen Beitrag sowohl zu den technischen als auch zu den wissenschaftlichen Fragen aus diesem Papier; Er machte wichtige Überlegungen zur Epigenetik und zu Videoaufnahme- und Formatierungstechniken (guilherme.telles@usp.br). Finanzierung von Verbrauchsmaterialien: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) und National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Persönliche Förderung: (FAPESP: #2014/16740-6) und Academic Excellence Program von Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES: 88882.180020/2018-01). Die Daten werden uneingeschränkt öffentlich und frei zugänglich gemacht. Adresskorrespondenz an NYN (E-Mail: nataliayumi@usp.br) oder CBN (E-Mail: carla@fmrp.usp.br).
Materials
| Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
| Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
| Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
| EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
| HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
| Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
| MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
| MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
| NaOH | F. MAIA | 114700 | |
| PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
| PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
| 2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
| RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
| RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
| STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
| TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
| Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
| 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
| XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
| XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
| XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
| XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |
References
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