Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Nat&#225;lia Yumi Noronha; Guilherme da Silva Rodrigues; Marcela Augusta de Souza Pinhel; Jean-Baptiste Cazier; L&#237;gia Moriguchi Watanabe; Albert Nobre Menezes; Carlos Roberto Bueno; Carolina Ferreira Nicoletti; Bruno Affonso Parenti de Oliveira; Isabelle Mello Schineider; Isabella Harumi Yonehara Noma; Igor Caetano Dias Alcar&#225;s; Fernando Barbosa; Carla Barbosa Nonino

doi:10.3791/62598

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Genetics

Préparation d’échantillons à l’analyse bioinformatique de la méthylation de l’ADN: stratégie d’association pour l’obésité et les études sur les traits connexes

Published: May 06, 2022

doi:

10.3791/62598

Natália Yumi Noronha*¹, Guilherme da Silva Rodrigues*¹, Marcela Augusta de Souza Pinhel¹, Jean-Baptiste Cazier^2,3, Lígia Moriguchi Watanabe¹, Albert Nobre Menezes⁴, Carlos Roberto Bueno⁵, Carolina Ferreira Nicoletti¹, Bruno Affonso Parenti de Oliveira¹, Isabelle Mello Schineider⁶, Isabella Harumi Yonehara Noma⁷, Igor Caetano Dias Alcarás⁸, Fernando Barbosa⁹, Carla Barbosa Nonino⁶

¹Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, ²Centre for Computational Biology,University of Birmingham, ³Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences,University of Birmingham, ⁴Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine,The University of Edinburgh, ⁵Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport,University of São Paulo, ⁶Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School,University of Sao Paulo, ⁷Faculty of Pharmaceutical Sciences,University of São Paulo, ⁸Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, ⁹Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto,University of São Paulo

Summary

La présente étude décrit le flux de travail pour gérer les données de méthylation de l’ADN obtenues par les technologies de microréseaux. Le protocole illustre les étapes allant de la préparation de l’échantillon à l’analyse des données. Toutes les procédures sont décrites en détail et la vidéo montre les étapes importantes.

Abstract

L’obésité est directement liée au mode de vie et a été associée à des changements de méthylation de l’ADN qui peuvent entraîner des altérations de l’adipogenèse et des processus de stockage des lipides contribuant au développement de la maladie. Nous démontrons un protocole complet allant de la sélection à l’analyse des données épigénétiques des patients avec et sans obésité. Toutes les étapes du protocole ont été testées et validées dans le cadre d’une étude pilote. 32 femmes ont participé à l’étude, dans laquelle 15 personnes ont été classées avec obésité selon l’indice de masse corporelle (IMC) (45,1 ± 5,4 kg / ^m2); et 17 personnes ont été classées sans obésité selon l’IMC (22,6 ± 1,8 kg/^m2). Dans le groupe obèse, 564 sites CpG liés à la masse grasse ont été identifiés par une analyse de régression linéaire. Les sites cpg se trouvaient dans les régions promotrices. L’analyse différentielle a révélé 470 CpG hypométhylés et 94 sites hyperméthylés chez les personnes obèses. Les voies enrichies les plus hypométhylées étaient dans le RUNX, la signalisation WNT et la réponse à l’hypoxie. Les voies hyperméthylées étaient liées à la sécrétion d’insuline, à la signalisation du glucagon et au ^Ca2+. Nous concluons que le protocole a efficacement identifié les modèles de méthylation de l’ADN et la méthylation de l’ADN liée aux traits. Ces modèles pourraient être associés à une altération de l’expression des gènes, affectant l’adipogenèse et le stockage des lipides. Nos résultats ont confirmé qu’un mode de vie obésogène pourrait favoriser des changements épigénétiques dans l’ADN humain.

Introduction

Les technologies omiques à grande échelle sont de plus en plus utilisées dans les études sur les maladies chroniques. Une caractéristique intéressante de ces méthodes est la disponibilité d’une grande quantité de données générées pour la communauté scientifique. Par conséquent, une demande de normalisation des protocoles est apparue pour permettre une comparaison technique entre les études. La présente étude suggère la normalisation d’un protocole pour obtenir et analyser des données de méthylation de l’ADN, en utilisant une étude pilote comme exemple appliqué.

La dépense énergétique négative prédomine dans les modes de vie humains modernes, conduisant à une accumulation excessive de tissu adipeux et, par conséquent, au développement de l’obésité¹. De nombreux facteurs ont augmenté les taux d’obésité, tels que le sédentarisme, les régimes riches en calories et les routines stressantes. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a estimé que 1,9 milliard d’adultes étaient obèses en 2016, ce qui signifie que plus de 20% de la population mondiale a un IMC de plus de 30 kg/^m22. La mise à jour la plus récente de 2018 a révélé que la prévalence de l’obésité aux États-Unis d’Amérique (USA) était supérieure à 42 %³.

L’épigénétique est l’adaptation structurelle des régions chromosomiques pour enregistrer, signaler ou perpétuer des états d’activité ^altérés4. La méthylation de l’ADN est une altération chimique réversible dans les sites de dinucléotides cytosine-guanosine (sites CpG), formant la 5-méthylcytosine-pG (5mCpG). Il peut moduler l’expression des gènes en régulant l’accès de la machinerie de transcription à l’ADN5,6,7,8. Dans ce contexte, il est essentiel de comprendre quels sites cpG sont associés à des traits liés à l’obésité9. De nombreux facteurs peuvent soutenir ou empêcher la méthylation de l’ADN spécifique au site. Les enzymes nécessaires à ce processus, telles que les méthyltransférases ^d’ADN10 (DNTM) et les dix-onze translocations (TET), peuvent favoriser la méthylation ou la déméthylation de l’ADN lors d’expositions ^{environnementales11}.

Compte tenu de l’intérêt croissant pour les études sur la méthylation de l’ADN au cours des dernières années, le choix de la stratégie d’analyse la plus appropriée pour répondre précisément à chaque question a été une préoccupation essentielle des ^{chercheurs12,13,14}. Le réseau de méthylation de l’ADN 450K est la méthode la plus populaire, utilisée dans plus de 360 ^{publications14} pour déterminer le profil de méthylation de l’ADN. Il peut déterminer la méthylation de jusqu’à 485 000 CpG situés dans 99 % des gènes ^connus15. Cependant, cette baie a été abandonnée et remplacée par l’EPIC, couvrant 850 000 sites CpG. Le protocole actuel peut être appliqué à la fois pour 450K et EPIC16,17,18.

Le protocole est présenté étape par étape à la figure 1 et comprend les étapes suivantes : sélection de la population, échantillonnage, préparation d’expériences, pipeline de méthylation de l’ADN et analyse bioinformatique. Une étude pilote réalisée dans notre laboratoire est démontrée ici pour illustrer les étapes du protocole proposé.

Figure 1: Schéma du protocole présenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

Le comité d’éthique de l’hôpital universitaire Ribeirão Preto Medical School de l’Université de São Paulo (HCRP-USP) a approuvé l’étude (CAAE:14275319.7.0000.5440). Les participants ont signé le formulaire de consentement et toutes les procédures ont été menées à la suite de la Déclaration d’Helsinki. 1. Population et échantillonnage Recruter des participants ayant un IMC >30 kg/m2 pour l’étude. Pour la présente étude, 32 femmes issues d’une population mixte19 âgées de 18 à 60 ans ont été recrutées.NOTE: Dans le HCRP-USP, des taux plus élevés d’obésité ont été observés principalement chez les femmes20. Les participants obèses, avec un IMC ≥30 kg/m2 (n = 15), ont été recrutés à la clinique externe des maladies métaboliques dans HCRP-USP. Les participants sans obésité, avec un IMC compris entre 18,5 kg/m2 et 24,9 kg/m2 (n = 17), ont été recrutés dans d’autres cliniques et n’avaient pas de maladies graves ; les données cliniques sont présentées dans le tableau 1. Exclure les femmes enceintes, allaitantes, fumeuses et consommant de l’alcool. 2. Anthropométrie et composition corporelle Mesurez le poids des participants à l’aide d’une échelle anthropométrique numérique de 200 kg. Assurez-vous d’enlever les chaussures et les vêtements en excès. Évaluez la hauteur à l’aide d’un stadiomètre avec une graduation de 0,5 cm. Les participants ont reçu l’instruction de se tenir pieds nus, les pieds joints et les bras à leurs côtés21. Collectez les informations sur la masse grasse (FM) à l’aide d’une bioimpédance électrique. Après 12 h de jeûne, évaluer avec une vessie vide. Placez les participants en position couchée, les jambes écartées et les bras parallèles sans toucher le corps. Demandez aux participants de retirer tous les accessoires métalliques22. Obtenir le tour de taille (WC) à l’aide d’un ruban à mesurer inextensible avec une graduation de 0,1 mm. Le ruban a été placé horizontalement autour de la taille moyenne, juste au-dessus des os de la hanche. La mesure a eu lieu juste après une expiration. Selon les Centers for Diseases Control and Prevention (CDC), la limite de WC pour les femmes est de 88 cm23. Tableau 1 : Caractéristiques de la population. Toutes les variables étaient paramétriques (p > 0,05, Shapiro Wilk), et les différences ont été évaluées à l’aide d’un test t indépendant, dans lequel p < 0,05 a été considéré comme significatif. *p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 3. Collecte de matériel biologique Prélever du sang périphérique après 12 h de jeûne, comme décrit précédemment24. Prélever 4 mL d’échantillons de sang total dans des tubes de prélèvement avec un anticoagulant (p. ex. EDTA) et les conserver sur de la glace pour le transport. 4. Extraction de l’ADN Centrifuger chaque tube contenant le sang à 2 000 x g pendant 10 min. Recueillir environ 300 μL du pelage bouffant (interphase blanche). Extraire l’ADN du sang périphérique à l’aide d’un instrument disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux), comme décrit précédemment25. Éluez l’ADN dans 480 μL de H2O ultrapur. Évaluer la concentration et la qualité de l’ADN à l’aide d’un fluoromètre. L’intégrité a été évaluée à l’aide d’une analyse de gel d’agarose à 1 . Conserver au congélateur à -80 °C. 5. Préparation avant analyse de méthylation Assurez-vous que les échantillons ont la concentration minimale d’ADN (500 ng est l’entrée initiale idéale pour commencer), mais la dilution peut varier d’un échantillon à l’autre à cette étape. Certains réactifs ne sont pas inclus dans le kit de microréseau26, alors achetez-les séparément27. Vérifiez si le kit contient tous les réactifs utilisés pendant la procédure; ils sont irremplaçables. Vérifiez la date d’expiration de tous les réactifs. S’assurer que d’autres réactifs et solutions non fournis dans la trousse sont également disponibles (95 % de formamide/1 mM d’EDTA, 0,1 N NaOH, éthanol absolu, 2-propanol).ATTENTION : Le formamide est un réactif volatil ; la qualité des résultats peut être améliorée si le produit est frais. L’intégrité et la qualité du formamide et de l’éthanol absolu sont considérées comme essentielles car elles peuvent affecter le processus de coloration proposé par le fabricant. Les alcools choisis doivent être des produits ultrapurs spécifiques à l’analyse de biologie moléculaire. Une fois le kit de microréseau acquis, téléchargez les cartes de décodage des puces (DMAP). Ces fichiers sont disponibles sur le site Web du fabricant 24-48 h après l’expédition du kit et sont exclus à la date d’expiration28. Pour télécharger les fichiers mentionnés, effectuez les étapes ci-dessous. Assurez-vous qu’un ordinateur avec accès à Internet est disponible. Effectuez le téléchargement à l’aide du client de fichiers de décodage logiciel. Avant d’installer le programme, assurez-vous que l’ordinateur dispose d’un accès sortant et entrant accordé par l’institution; le client de fichiers de décodage n’a pas de restrictions de sécurité. Connectez-vous au logiciel Decode File Client à l’aide de l’option Access by BeadChip. Cette connexion est effectuée à l’aide de l’ID utilisateur et du mot de passe MyIllumina. L’inscription sur cette page est obligatoire28. Après vous être connecté au client de fichiers décodés, entrez les informations répertoriées ci-dessous dans leurs champs respectifs sur la page d’accueil du logiciel28: Liste des codes à barres; Liste des ID de boîte; Numéro de bon de commande (PO); et Numéro de commande client (n’oubliez pas de ne pas inclure les lettres qui suivent les chiffres). Sélectionnez les DMAP à télécharger en fonction du numéro de code-barres dans la zone d’achat et spécifiez la destination dans la boîte de dialogue pour enregistrer les DMAP. Cliquez sur le bouton pour lancer le téléchargement.REMARQUE: À la fin du téléchargement, assurez-vous que les dossiers téléchargés ne sont pas vides et stockez les fichiers en toute sécurité, car ils seront nécessaires à l’étape finale pour convertir les expériences en fichiers de données d’intensité (fichiers IDAT). Après la date d’expiration, Illumina peut supprimer les données DMAP de sa base de données en ligne. 6. Pipeline de méthylation de l’ADN REMARQUE: L’expérience de méthylation de l’ADN est divisée en 4 jours (Figure 1). Suivez les recommandations et les spécifications du fabricant pour obtenir des résultats précis. Jour 1 : Traitement au bisulfite Commencez par dénaturer 500 ng d’ADN génomique, puis ajoutez les réactifs de conversion. Pour effectuer cette étape, suivez les recommandations des kits de bisulfite et de microréseau29. Traiter l’ADN dénaturé avec 130 μL du réactif de conversion du bisulfite à la concentration standard fournie par le fabricant. Incuber le tube dans un thermocycleur pendant 16 cycles à 95 °C pendant 30 s et à 50 °C pendant 1 h. Descendez le thermocycleur à 4 °C pendant 10 min. Effectuez l’étape de lavage en ajoutant 100 μL de tampon de lavage, puis en centrifugant à pleine vitesse pendant 30 s. La concentration n’est pas fournie dans le guide de l’utilisateur et le fabricant normalise les volumes.REMARQUE: Ce réactif est livré avec le kit et n’a pas besoin d’être dilué ou préparé. Jour 2: Amplification – Test de méthylation, protocole manuel Préchauffer le four d’hybridation à 37 °C et laisser la température s’équilibrer. Appliquez une étiquette de code-barres sur une microplaque de 0,8 mL. Décongelez les réactifs d’amplification (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix et Multi-Sample Amp Master Mix) à température ambiante (ces réactifs sont livrés avec le kit et n’ont pas besoin d’être dilués ou préparés). Ensuite, effectuez une inversion douce d’au moins 10x jusqu’à ce que tout le contenu des tubes soit mélangé. Distribuer 20 μL du Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) dans les puits de la plaque. Transférer 4 μL de l’échantillon d’ADN de la plaque convertie en bisulfite vers les puits correspondants sur la plaque de 0,8 mL. À ce stade, enregistrez l’ID de l’échantillon d’ADN original sur le formulaire de suivi de laboratoire correspondant aux puits de plaque. Distribuer 4 μL de NaOH 0,1 N dans chaque puits de la plaque contenant le mélange d’amplification multi-échantillons 1 (MA1) et l’échantillon d’ADN. Scellez la plaque avec un joint en plastique. Vortex la plaque pour mélanger les réactifs avec les échantillons à 1 600 tr/min pendant 1 min. Incuber pendant 10 min à température ambiante et retirer soigneusement le joint. Pipette 68 μL de Random Primer Mix (RPM) dans chaque puits de la plaque. Pipette 75 μL de Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) dans chaque puits de la plaque (sans retirer la solution précédente). Utilisez un nouveau joint pour couvrir la plaque.REMARQUE: Prenez soin de combiner les puits avec la plaque et orientez-la correctement. Vortex la plaque scellée à 1 600 tr/min pendant 1 min. Incuber dans le four d’hybridation pendant 20-24 h à 37 °C. Jour 3: Hybridation – Test de méthylation, protocole manuelPréchauffer le bloc à 37 °C. Décongeler le contenu du tube à température ambiante. Inverser soigneusement et doucement les tubes de la solution de fragmentation (FMS) au moins 10x pour bien mélanger le contenu. Retirez soigneusement la plaque du four d’hybridation. Centrifuger la plaque à 280 x g. Maintenant, retirez le joint de la plaque. Dans chaque puits de la plaque contenant un échantillon, ajouter 50 μL de solution de fragmentation (FMS) et sceller à nouveau la plaque. Vortex la plaque à 1 600 tr/min pendant 1 min. Centrifugez la plaque à 280 x g pendant quelques secondes (effectuez une centrifugation par impulsions). Ensuite, placez la plaque scellée sur le bloc chauffant à 37 °C pendant 1 h. S’il était décidé de mettre l’expérience en pause et de congeler la plaque, de la décongeler à température ambiante et de la centrifuger à 280 x g. S’il n’est pas gelé, ignorez cette étape et passez à l’étape 6.3.7. Laissez le bloc chauffant préchauffer à 37 °C. Laissez le tampon de lavage décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, inversez-le au moins 10x pour mélanger le contenu. Retirez le joint de la plaque. Ajouter 100 μL de solution de précipitation (PM1) à chaque puits de la plaque contenant des échantillons. Scellez à nouveau la plaque avec le joint. Vortex la plaque à 1 600 tr/min pendant 1 min. Incuber à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, placer dans la centrifugeuse à impulsions à 280 x g pendant 1 min.REMARQUE: Réglez la centrifugeuse à 4 °C pour l’étape suivante. Retirez soigneusement le joint de la plaque et jetez-le. Ajouter 300 μL de 2-propanol (100 %) à chaque puits contenant l’échantillon. Scellez la plaque avec un soin extrême à l’aide d’un nouveau joint. Veillez à ne pas secouer l’assiette. Inverser la plaque au moins 10x, en mélangeant tout le contenu. Incuber à 4 °C pendant 30 min. Centrifuger à 3 000 x g à 4 °C pendant 20 min.REMARQUE: À la fin de l’étape 6.3.20, retirez immédiatement la plaque de centrifugeuse. Retirez le joint de la plaque et jetez-le. Inverser rapidement la plaque et égoutter le liquide sur un tampon pour jeter le surnageant. Ensuite, frappez la plaque dans un endroit sec sur une serviette en papier pour égoutter le liquide. Tapotez fermement plusieurs fois pendant 1 min ou jusqu’à ce que tous les puits soient exempts de tout liquide. Laisser la plaque inversée et à découvert pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE: On s’attend à voir des granulés bleus au fond des puits. Préchauffer le four d’hybridation à 48 °C. Allumez le bloc chauffant pour le préchauffer. Prévoyez 20 min pour ce processus. Solution de remise en suspension, d’hybridation et de lavage de dégel à température ambiante. Inverser au moins 10x. Vérifiez qu’il n’y a pas de sel précipité dans la solution. Ajouter 46 μL de solution de remise en suspension, d’hybridation et de lavage (RA1) à chaque puits de la plaque.REMARQUE: Tous les réactifs restants doivent être réservés aux étapes de coloration et d’hybridation. Appliquez le joint sur la plaque. Utilisez un joint en aluminium pour couvrir la plaque. Tenez-vous bien pour effectuer l’étanchéité uniformément. Vérifiez si tous les puits sont fermés en toute sécurité pour éviter l’évaporation. Placer délicatement la plaque nouvellement scellée dans le four d’hybridation et incuber à 48 °C pendant 1 h. Vortex la plaque à 1 800 tr/min pendant 1 min. Centrifugeuse à impulsions à 280 x g. Transférer la plaque dans le bloc chauffant à 95 °C pendant 1 h. Préparez les chambres d’hybridation (Hyb) en les plaçant ensemble. Distribuer 400 μL de tampon humidifiant (PB2) dans les réservoirs des chambres Hyb. Mettez le couvercle immédiatement. Chargez chaque échantillon de la plaque dans l’ouverture d’entrée d’échantillon du microréseau. Chargez les inserts de la chambre Hyb contenant les microréseaux dans la chambre Hyb. Fermez la chambre Hyb transversalement pour éviter un éventuel déplacement de la chambre Hyb.REMARQUE: Les chambres hyb doivent être incubées à 48 °C pendant au moins 16 h, mais pas plus de 24 h. Jour 4: Coloration – Test de méthylation, protocole manuelRemettre en suspension la solution de coloration 4 avec 330 mL de 100% EtOH, obtenant un volume final de 350 mL. Agiter vigoureusement le flacon staining Solution 4 pour assurer une remise en suspension complète. Conserver à température ambiante.REMARQUE: La solution de coloration 4 peut être conservée jusqu’à 2 semaines à une température comprise entre 2 ° C et 8 ° C. Retirez les chambres du four d’hybridation et laissez-les refroidir sur le banc pendant 30 minutes avant de les ouvrir. Pendant que la chambre Hyb refroidit, remplissez deux récipients de lavage avec un tampon de lavage (200 mL par récipient de lavage). N’oubliez pas d’étiqueter chaque récipient comme « tampon de lavage » (PB1 et PB2). Remplissez les accessoires d’alignement du microréseau avec 150 mL de tampon de lavage. Séparez les entretoises en plastique et, si nécessaire, nettoyez le verre. Pour laver les glissières de microréseau, fixez la boucle de fil à la grille et immergez l’équipement de goutte à goutte dans les conteneurs avec 200 mL de tampon de lavage pour un total de 10x. Retirez tous les inserts de la chambre d’hybridation et retirez chaque tableau des inserts. Retirez le joint.REMARQUE: Pendant le retrait, ne touchez pas les matrices exposées. Lorsque vous retirez les glissières de microréseau de la chambre d’hybridation, veillez à ne rien renverser. Lavez les microréseaux dans la solution tampon de lavage (PB1) lentement et légèrement, en remontant et en descendant de 10x. Passez à une solution PB1 fraîche et effectuez le lavage en déplaçant lentement les microréseaux 10x de haut en bas dans la solution. Retirez le microréseau du récipient et confirmez l’absence de résidu. Utilisez une entretoise transparente en haut de chaque microréseau et guidez les entretoises vers les positions correspondantes.REMARQUE: Veillez à n’utiliser que les entretoises transparentes, pas les blanches. Placez la barre d’alignement sur l’accessoire d’alignement. Placez une plaque arrière en verre sur le dessus de l’entretoise transparente; veillez à couvrir l’ensemble du microréseau. Ensuite, fixez des pinces métalliques aux chambres d’écoulement. Si nécessaire, utilisez des ciseaux pour couper les extrémités des entretoises de la chambre d’écoulement. Lavez immédiatement les réservoirs de la chambre d’hybridation à l’aide de ddH2O et frottez avec une petite brosse de nettoyage. Ne laissez aucun tampon humidifiant rester dans le réservoir. Passez à l’étape suivante responsable de l’extension et de la coloration du microréseau.REMARQUE: Laissez toutes les chambres d’écoulement montées horizontalement sur le banc de laboratoire. Ne les re-manipulez que lorsque toute l’étape de coloration est prête. Chauffer la solution de remise en suspension, d’hybridation et de lavage à une température comprise entre 20 °C et 25 °C. Mélanger doucement jusqu’à ce qu’aucun cristal ne soit vu dans la solution. Placez les réactifs dans un rack dans l’ordre. S’ils sont congelés, laissez-les à température ambiante, puis inversez-les au moins 10 fois pour mélanger les solutions. Remplissez le circulateur d’eau au niveau approprié. Allumez la pompe et réglez la température à 44 °C. Retirez toutes les bulles fixées au rack de la chambre. Effectuez des tests sur le rack de la chambre à l’aide d’une sonde de température. Tous les emplacements testés doivent être compris entre 44 °C ± 0,5 °C.REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées sans interruption. Lorsque le rack atteint une température de 44 °C, placez rapidement chaque assemblage dans la chambre d’écoulement.REMARQUE: Pour les étapes suivantes, pipettez tous les réactifs dans la plaque de verre arrière. Pipette 150 μL de solution de remise en suspension, d’hybridation et de lavage (RA1). Ensuite, incuber pendant 30 min. Répétez cette étape un total de 5x. Pipette 450 μL de solution de coloration 1 (XC1) et incubation pendant 10 min. Pipette 450 μL de solution de coloration 2 (XC2) et incubation pendant 10 min. Pipette 200 μL de Two-Color Extension Master Mix (TEM) et incubation pendant 15 min. Pipette 450 μL de formamide à 95% /1 mM d’EDTA et incubation pendant 1 min. Répéter deux fois. Incuber pendant 5 min. Diminuer la température du rack de la chambre à 32 °C (indiquée sur Superior Two-Color Master Mix). Pipette 450 μL de Stain Solution 3 (XC3) et incubation pendant 1 min. Répéter 1x. Attendez que le rack dans la chambre atteigne la bonne température.REMARQUE: Pour lire l’image du microréseau immédiatement après le processus de coloration, allumez le scanner à ce stade. Distribuez maintenant 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), suivi d’une incubation de 10 minutes. Ensuite, distribuer 450 μL de Stain Solution 3 (XC3), suivi d’une incubation de 1 min. Répétez 1x. Attendez 5 min, puis ajoutez 250 μL de Mélange maître anti-taches 2 couleurs (ATM) et incubez pendant 10 min. Distribuez maintenant 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), suivi d’une incubation de 10 minutes. Ensuite, distribuer 450 μL de Stain Solution 3 (XC3), suivi d’une incubation de 1 min. Répétez 1x. Attendez 5 min. Ajouter 250 μL de Mélange Maître Anti-Taches 2 Couleurs (ATM) et incuber pendant 10 min. Ajouter 450 μL de Stain Microarray Solution 3 (XC3) et incuber pendant 1 min, puis répéter à nouveau. Attendez 5 min.REMARQUE: Effectuez le schéma de répétition suivant: Étape 6.4.34., Étape 6.4.35. et l’étape 6.4.36.; Étape 6.4.37., 6.4.38. et Étape 6.4.39.; Étape 6.4.34., Étape 6.4.35. et Étape 6.4.36. Maintenant, retirez immédiatement les chambres d’écoulement du rack et placez-les soigneusement horizontalement sur le banc de laboratoire. Assurez-vous que la température est ambiante. 6.4.41.Placer 310 mL de solution de lavage (PB1) pour chaque microréseau dans un récipient de lavage. Retirez les pinces métalliques et le verre, et enfin, le microréseau. Placez les microréseaux sur un support de coloration et placez-les dans le récipient de lavage contenant 10x solution de PB1. Assurez-vous que les codes-barres sont éloignés de celui qui les manipule et que tous les microréseaux sont submergés. Déplacez-vous lentement et légèrement avec des mouvements de haut en bas 10x. Le microréseau doit être entièrement retiré de la solution avant d’être immergé à nouveau. Ensuite, laissez-le rester immergé pendant 5 min. Agiter vigoureusement le réactif Stain Solution 4 (XC4) pour assurer une remise en charge totale. Placer 310 mL de XC4 dans un récipient de lavage.REMARQUE: Ne laissez pas la solution reposer dans le récipient de lavage pendant plus de 10 minutes. Déplacez légèrement le support de coloration vers l’autre récipient avec XC4. Déplacez-vous lentement et légèrement avec des mouvements de haut en bas 10x. Assurez-vous que le microréseau est entièrement retiré de la solution avant d’être immergé à nouveau. Ensuite, laissez le microréseau rester immergé pendant 5 min. Déplacez le support de coloration hors de la solution et placez-le dans un porte-tube avec les codes-barres tournés vers le haut. Retirez soigneusement le microréseau à l’aide de pinces verrouillables et placez-les sur une étagère pour sécher. Séchez-les à l’aide du dessiccateur sous vide pendant 50-55 min à 675 mm Hg (0,9 bar). Nettoyez l’arrière de chaque microréseau à l’aide d’EtOH.ATTENTION: Évitez de toucher les rayures et ne laissez pas l’EtOH s’égoutter sur les rayures de quelque manière que ce soit. Passez à l’image du microréseau. Conservez soigneusement le microréseau dans une boîte de rangement à température ambiante.REMARQUE: Les images de microréseaux doivent être prises dans les 72 heures. 7. Analyse bioinformatique REMARQUE: Il est nécessaire de modifier certains attributs du type de microréseau (par exemple, arraytype = « 450k » doit être remplacé par arraytype = « EPIC »). L’auteur du pipeline ChAMP décrit en détail tous les champs qui doivent être modifiés pour analyser les matrices sur la page Bioconducteur du package30. Exemple de feuille Transférez les fichiers IDAT sur l’ordinateur pour procéder à l’analyse bioinformatique31. Créez un exemple de feuille pour effectuer l’analyse des données31.REMARQUE : Trois colonnes sont essentielles pour ce fichier de feuille de calcul. La première est Sample_name. Cette colonne doit inclure les noms ou codes utilisés pour identifier les échantillons. La seconde est la Sentrix_position. Cette colonne place le R01C01 correspondant des échantillons, R01 étant responsable de la ligne de puce et la colonne étant appelée C01. La troisième colonne essentielle est la Sentrix_ID, et il est responsable de recevoir le numéro qui identifie le microréseau. Assurez-vous de mettre les bons chiffres. Il est possible d’ajouter d’autres informations sur la feuille d’échantillon en tant que valeurs variables. Dans la présente expérience, les données de l’analyse des métaux ont été incluses. Pipeline ChAMP Installez RStudio (V.4.0.2) sur l’ordinateur pour effectuer l’analyse30.REMARQUE: Assurez-vous que l’ordinateur dispose d’un minimum de 8 G de RAM. L’analyse des données aura du mal ou se bloquera avec une quantité inférieure de RAM. Après l’installation, ouvrez RStudio et installez le package ChAMP Bioconductor30 à l’aide de la ligne de commande correspondante (voir Matériel supplémentaire 1).REMARQUE: S’il y a une erreur à la fin de l’installation, installez les bibliothèques ChAMP requises manuellement, une par une26. Maintenant, importez les données brutes et effectuez l’analyse. Voir le document supplémentaire 1.champ.load() importe les données brutes et effectue le processus de filtrage, à l’exclusion des sondes à faible pval de détection, des sites multihit, des sondes non CG, des sites CpG proches des SNP et des CpG situés dans les chromosomes sexuels.champ.impute() effectue l’imputation KNN par défaut.champion. QC récupère des graphiques de qualité des données (par exemple, un graphique de diagramme de densité).champion. SVD évalue les effets de lot en fonction des métadonnées fournies dans la feuille d’exemple.champ.refbase() effectue l’estimation et la correction du type de cellule.champion. DMP( ) récupère des positions méthylées différentiellement et des associations de caractères telles que la masse grasse pour vérifier la méthylation de l’ADN entre les groupes et modifier les paramètres, comme indiqué dans le matériel supplémentaire 1. Enrichissement (String DB)REMARQUE: L’enrichissement fonctionnel est utilisé pour déduire les fonctions biologiques d’un ensemble de gènes. Pour enrichir les données d’une chaîne, sélectionnez la liste des cibles à enrichir et à utiliser comme entrée à partir de : https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form=multiple_identifiers Pour organisme, sélectionnez homo sapiens et appuyez sur le bouton Rechercher. Pour naviguer dans l’enrichissement, cliquez sur le bouton Analyse. Soumission GEO Déposez les données dans un référentiel public tel que le GEO de NCBI. Pour cela, inscrivez-vous pour le compte de l’expéditeur.REMARQUE: Complétez la soumission GEO (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) en téléchargeant la feuille de métadonnées avec des informations descriptives et des protocoles pour l’expérience globale et les échantillons individuels. Les soumissions d’archives GEO peuvent être créées dans n’importe quel tableur. Deuxièmement, ajoutez le fichier de données brutes généré à partir du script de comptage cell-ranger pour toutes les bibliothèques dans le répertoire. IDAT et fichiers associés ou une feuille de calcul matricielle contient des données non normalisées. Le troisième dossier est constitué par les fichiers de données traités. Le tableau matriciel est une feuille de calcul contenant les valeurs finales normalisées comparables entre les lignes et les échantillons et de préférence traitées comme décrit dans tout manuscrit d’accompagnement. Placez les fichiers de données traités générés à partir du script de comptage cell-ranger pour toutes les bibliothèques dans le répertoire. Utilisez les informations d’identification du serveur FTP de l’expéditeur GEO pour transférer le répertoire contenant les trois composants.

Representative Results

Après avoir utilisé le pipeline ChAMP, 409 887 sondes ont été prises en compte dans l’analyse après tous les filtres (CpG non qualifiés, sondes non CG, CpG près des SNP, sites multihit et CpG liés à XY); un schéma est représenté à la figure 2. Figure 2: Pipeline de l’analyse bioinformatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. De plus, le diagramme de densité a révélé que tous les échantillons avaient des densités similaires de la distribution bêta liées aux étapes de contrôle de la qualité. Cette analyse évalue la distribution des valeurs bêta et indique s’il y a des échantillons qui doivent être exclus. Dans ce lot, aucun échantillon n’a été exclu sur la base de cette analyse. Figure 3 : Diagramme de densité des valeurs bêta obtenu avec le package ChAMP. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre. L’analyse de décomposition en valeur singulière (SVD) a été utilisée pour vérifier les principaux composants qui ont influencé de manière significative la variabilité des données de méthylation de l’ADN. Les données ont révélé que l’IMC, le WC (p < 1e10-5) et le FM (p < 0,05) ont eu un effet significatif sur la variabilité des données (figure 4). Figure 4: Analyse de la décomposition des valeurs singulières. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. L’estimation du type cellulaire a révélé que les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules B étaient plus élevées chez les femmes obèses (figure 5). Figure 5 : Fractions cellulaires estimées par la méthode de Houseman. Gran: granulocyte. CD4T : lymphocyte T auxiliaire. CD8T : lymphocyte T cytotoxique. Mono: monocyte. Cellule B : lymphocyte B. NK: cellules tueuses naturelles, lymphocytes. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Les niveaux de méthylation de l’ADN entre les femmes obèses et non obèses différaient avant et après la correction du type cellulaire. Avant la correction des données de méthylation de l’ADN pour les types de cellules, 43 463 positions méthylées différentiellement (DMP) ont été observées, et 3 329 CpG sont restés significatifs par la suite. 445 sites CpG se trouvaient dans des régions intergéniques (IGR) et 2 884 dans des régions géniques, la plupart se trouvant dans la région promotrice (n = 1 438). La distribution dans toutes les régions était TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5’UTR (n = 390), premier exon (n = 273), corps (n = 724) et 3’UTR (n = 59). Si l’on considère les valeurs de Δβ 0,05, 162 CpG étaient hypométhylés et 576 étaient hyperméthylés chez les personnes obèses par rapport aux personnes non obèses (figure 6). Les données sont disponibles dans la base de données GEO sous le code de registre GSE166611. Figure 6: Positions méthylées différentiellement. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure. Il est possible d’évaluer les différentes méthylations entre les groupes et de trouver des sites CpG associés à des traits spécifiques dans les études de méthylation. Pour les études sur la masse grasse, 13 222 sites CpG ont été trouvés. 6 159 CpG dans la région promotrice étaient liés à la masse grasse, dont 470 hyperméthylés et 94 hypométhylés (figure 7), et les gènes respectifs ont été enrichis (tableau 2). Figure 7: Régions promotrices des gènes hypométhylés et hyperméthylés, indépendamment liés à la masse grasse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Tableau 2 : Enrichissement fonctionnel des gènes à partir des sites CpG méthylés différentiellement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Matériel supplémentaire 1 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les réseaux de méthylation de l’ADN sont les méthodes les plus utilisées pour accéder à la méthylation de l’ADN en raison de leur rapport ^{coût-bénéfice14}. La présente étude décrit un protocole détaillé utilisant une plate-forme de microréseau disponible dans le commerce pour évaluer la méthylation de l’ADN dans une étude pilote réalisée dans une cohorte brésilienne. Les résultats obtenus à partir de l’étude pilote ont confirmé l’efficacité du protocole. La figure 3 montre la comparabilité de l’échantillon et la conversion complète du bisulfite32.

En tant qu’étape de contrôle de la qualité, l’algorithme ChAMP a recommandé l’exclusion des sites CpGs pendant le processus de filtrage. L’objectif de l’exclusion des sondes est d’améliorer l’analyse des données et d’éliminer les biais. Les CpG de faible qualité (valeurs de p inférieures à 0,05) ont été supprimés pour éliminer le bruit expérimental dans l’ensemble de données. Les objectifs sont restés dépassés dans l’analyse du diagramme de densité. ^Zhou33 a décrit l’importance de filtrer les CpG près des SNP pour éviter les incohérences, la mauvaise interprétation de la méthylation des cytosines polymorphes et la cause de la couleur de commutation de la conception de sonde de type ^I34. De plus, comme les chromosomes XY sont affectés différemment par l’empreinte, Heiss et ^Just35 ont renforcé l’importance de filtrer ces sondes car, chez les femelles, les problèmes d’hybridation peuvent être des facteurs de ^confusion35.

La date d’expiration du DMAP, la date d’ouverture du formamide, la qualité analytique de l’éthanol absolu et le nombre total de leucocytes sont considérés comme des étapes critiques du protocole.

De plus, selon nos observations, l’estimation du type cellulaire est essentielle dans la réalisation de l’analyse bioinformatique. La méthode Houseman effectue l’estimation du type de cellule comme décrit dans l’étude de ^Tian30. Cette méthode est basée sur 473 sites CpG spécifiques qui peuvent prédire les pourcentages des types de cellules les plus importants, tels que les granulocytes, les monocytes, les cellules B et les cellules ^T36. Nous avons utilisé la fonction recommandée « myRefbase » du paquet ChAMP. Après l’estimation, l’algorithme ChAMP ajuste les valeurs bêta et élimine ce biais de l’ensemble de données. Cette étape est cruciale dans les études axées sur l’obésité car cette population présente une différence considérable dans les globules blancs en raison de leur état inflammatoire chronique.

Nous avons uniquement modifié la carte de capuchon d’origine pour le sceau PCR commun en ce qui concerne la modification de la méthode et le dépannage. Après chaque processus de centrifugation, le sceau a été changé pour un nouveau. Nous n’avons pas pu utiliser l’étanchéité thermique standard et l’avons adaptée en utilisant du papier d’aluminium autour de la plaque.

Bien que les essais commerciaux aient été considérés comme une norme d’or pour les études épigénétiques, l’une des limites du protocole pourrait être la spécificité des réactifs et de l’équipement ^d’une marque unique37,38,39,40. Une autre limite est le manque d’indicateurs permettant d’identifier la progression correcte de ^{l’expérience41}.

La normalisation du présent protocole représente un excellent guide pour la recherche épigénétique, réduisant les erreurs humaines au cours du processus et permettant une analyse réussie des données et la comparabilité entre différentes études.

Selon nos résultats, les expériences de méthylation de l’ADN conviennent aux études comparant des individus avec et sans ^obésité43. De plus, l’analyse bioinformatique proposée a fourni des données de haute qualité et pourrait être prise en compte dans des études à grande échelle.

En utilisant l’analyse SVD, nous avons identifié que les traits liés à l’obésité (IMC, WC et FM) influençaient la variabilité des données de méthylation de l’ADN. En conséquence significative, l’estimation du type cellulaire indique que les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules B étaient plus élevées chez les femmes obèses que chez les femmes non obèses (figure 5). Le nombre plus élevé de ces cellules pourrait s’expliquer par l’état inflammatoire de bas grade de ces ^individus44. Nous avons observé que les patients obèses ont des CpG hypo- et hyperméthylés dans les régions promotrices des gènes associés à la masse grasse. La plupart des sites étaient hypométhylés, ce qui pourrait être lié à l’augmentation naturelle des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) chez ces individus. Cette condition de stress oxydatif peut favoriser la perturbance de la guanine au site dinucléotide, formant de la 8-hydroxy-2′-désoxyguanosine (8-OHdG), entraînant un site dinucléotidique 5mCp-8-OHdG et provoquant le recrutement d’enzymes TET. Tous ces événements pourraient être responsables de la promotion de l’hypométhylation et de l’hyperméthylation de l’ADN par différents mécanismes ^d’action45.

En outre, le taux d’adipogenèse semble augmenter chez les personnes obèses, avec environ 10% de nouvelles cellules aux anciennes ^{cellules46,47}. Les apports épigénétiques, mettant l’accent sur l’environnement obésogène, peuvent modifier les taux de prolifération et de différenciation des cellules, favorisant le développement de la masse ^grasse48. Les changements épigénétiques peuvent également affecter les programmes adipogéniques, facilitant ou limitant leur développement. Les facteurs de transcription primaires (PPARγ ou C/EBPα) ou l’assemblage de complexes multiprotéiques, positionnés dans des régions promotrices en aval exploitées en incluant ou excluant des enzymes modificatrices épigénétiques, régulent l’expression des gènes par hyper- ou hypométhylation45. La voie PPARγ a déjà été décrite pour modifier la voie WNT, qui avait des gènes enrichis dans cette étude. Bien que l’on ne sache toujours pas comment la signalisation WNT se produit pendant l’adipogenèse, des études récentes ont rapporté qu’elle pourrait jouer un rôle essentiel dans le métabolisme des adipocytes, en particulier dans des conditions ^{obésogènes49}.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) d’être disponible pour répondre à tous les doutes sur le paquet ChAMP. Nous remercions également Guilherme Telles, Msc. pour sa contribution aux questions techniques et scientifiques de cet article; il a fait des considérations importantes concernant l’épigénétique et les techniques de capture et de formatage vidéo (guilherme.telles@usp.br). Financement des consommables : Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP) (#2018/24069-3) et Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq : #408292/2018-0). Financement personnel : (FAPESP : #2014/16740-6) et Programme d’excellence académique de la Coordination pour le développement du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES: 88882.180020/2018-01). Les données seront rendues publiques et librement accessibles sans restriction. Correspondance d’adresse à NYN (e-mail: nataliayumi@usp.br) ou CBN (e-mail: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Absolute ethanol	J.T. Baker	B5924-03
Agarose gel	Kasvi	K9-9100
Electric bioimpedance	Quantum BIA 450 Q – RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit	ZymoResearch, Irvine, CA, USA	D5001
Formamide	Sigma	F9037
FMS—Fragmentation solution	Illumina	11203428	Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brazil	AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix	Illumina	11202880	Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix	Illumina	11203410	Supplied Reagents
NaOH	F. MAIA	114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization	Illumina	11291245	Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization	Illumina	11191130	Supplied Reagents
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution	Illumina	11292441	Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix	Illumina	15010230	Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix	Illumina	11288046	Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix	Illumina	11208309	Supplied Reagents
Ultrapure EDTA	Invitrogen	155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)	ByoSystems	4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1	Illumina	11208288	Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2	Illumina	11208296	Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3	Illumina	11208392	Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4	Illumina	11208430	Supplied Reagents

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Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

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