Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

Il trasferimento di informazioni genetiche dal DNA alle proteine attraverso gli mRNA è un processo biochimico complesso, che è regolato con precisione a tutti i livelli attraverso interazioni macromolecolari all’interno delle cellule. Per la regolazione traslazionale, le interazioni RNA-proteina conferiscono un ruolo critico per reagire rapidamente a vari stimoli e ^segnali1,2. Alcune interazioni RNA-proteina influenzano la stabilità dell’mRNA e quindi alterano il tempo in cui un RNA è attivo per via traslazionale. Altre interazioni RNA-proteina sono associate a meccanismi di ricodifica come il readthrough stop-codone, il bypassing o il frameshifting ribosomiale programmato (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, un certo numero di proteine leganti l’RNA (RBP) hanno dimostrato di interagire con gli elementi dell’mRNA stimolatorio e il meccanismo di traduzione per dettare quando e quanta ricodifica si verificherà nella cellula7,8,9,10,11. Pertanto, per analizzare il ruolo delle proteine leganti l’RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell’RNA, è fondamentale studiare in dettaglio i principi di interazione e le proprietà meccaniche di questi complessi RNA-proteina.

Decenni di lavoro hanno gettato le basi per studiare il processo di traduzione multi-fase e multi-componente, che si basa su una comunicazione intricata tra l’RNA e i componenti proteici del meccanismo di traduzione per raggiungere velocità e precisione12,13,14. Un passo successivo cruciale nella comprensione di eventi normativi complessi è determinare le forze, i tempi e i determinanti strutturali durante la traduzione ad alta precisione12,15,16,17. Lo studio della dinamica conformazionale dell’RNA e in particolare di come i fattori ausiliari trans-agenti agiscono sulla struttura dell’RNA durante la traslazione sono stati ulteriormente illuminati dall’emergere di strumenti a singola molecola, tra cui pinzette ottiche o guide d’onda in modalità zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ^,25,26.

Le pinzette ottiche (OT) rappresentano una tecnica a singola molecola altamente precisa, che è stata applicata per studiare molti tipi di processi dinamici dipendenti dall’RNA, tra cui la trascrizione e la traduzione26,27,28,29,30,31,32. L’uso di pinzette ottiche ha permesso di sondare in dettaglio le interazioni molecolari, le strutture degli acidi nucleici e le proprietà termodinamiche, la cinetica e l’energetica di questi ^{processi16,17,22,33,34,35,36,37,38,39} . Il test delle pinzette ottiche si basa sull’intrappolamento di oggetti microscopici con un raggio laser focalizzato. In un tipico esperimento OT, la molecola di interesse è legata tra due perle trasparenti (di solito polistirene) (Figura 1A)²⁷. Queste perle vengono poi catturate da trappole ottiche, che si comportano come molle. Pertanto, la forza applicata sulla molecola può essere calcolata in base allo spostamento del tallone dal centro del raggio laser focalizzato (centro trappola). Recentemente, le pinzette ottiche sono state combinate con la microscopia confocale (Figura 1B), consentendo misurazioni di fluorescenza o trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 40,41,42. Questo apre un campo completamente nuovo di possibili esperimenti che consentono la misurazione simultanea e, quindi, una correlazione precisa della spettroscopia di forza e dei dati di fluorescenza.

Qui, dimostriamo esperimenti che utilizzano le pinzette ottiche combinate con la microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-RNA che regolano il frameshifting traslazionale. Tra l’obiettivo e il condensatore, una cella di flusso con cinque canali consente l’applicazione continua del campione con flusso laminare. Attraverso i canali microfluidici, vari componenti possono essere iniettati direttamente, il che riduce il tempo di hands-on e consente un consumo di campioni molto ridotto durante l’esperimento.

In primo luogo, viene proposta una linea guida di base per assistere la progettazione di esperimenti OT e vengono discussi i vantaggi e le insidie di varie configurazioni. Successivamente, viene descritta la preparazione di campioni e flussi di lavoro sperimentali e viene fornito un protocollo per l’analisi dei dati. Per rappresentare un esempio, delineiamo i risultati ottenuti da esperimenti di stretching dell’RNA per studiare l’elemento RNA frameshifting SARS-CoV-2 (Figura 2A) con il fattore trans-agente l’isoforma corta della proteina antivirale zinco-dito (ZAP), che altera la traduzione dell’RNA virale da un frame di lettura ^{alternativo43}. Inoltre, è dimostrato che i ribosomi marcati con fluorescenza possono essere impiegati in questo saggio confocale OT, che sarebbe utile per monitorare la processività e la velocità del macchinario di traduzione. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per testare rapidamente l’effetto di diversi tamponi, ligandi o altri componenti cellulari per studiare vari aspetti della traduzione. Infine, vengono discusse le insidie sperimentali comuni e come risolverle. Di seguito, vengono delineati alcuni punti cruciali nella progettazione sperimentale.

Progettazione di costruzioni
In linea di principio, ci sono due approcci comuni per creare un costrutto di RNA compatibile ot. Il primo approccio impiega una lunga molecola di RNA che viene ibridata con maniglie di DNA complementari, producendo così un costrutto costituito da due regioni ibride RNA / DNA che fiancheggiano una sequenza di RNA a singolo filamento nel mezzo (Figura 2B). Questo approccio è impiegato nella maggior parte degli esperimenti ot RNA33,44,45.

Il secondo approccio sfrutta le maniglie dsDNA con sporgenze corte (circa 20 nt)^15,17. Queste sporgenze vengono poi ibridate con la molecola di RNA. Sebbene più complicato nella progettazione, l’uso di maniglie dsDNA supera alcune delle limitazioni del sistema ibrido DNA / RNA. In linea di principio, è possibile implementare anche maniglie molto lunghe (>10kb), il che è più conveniente per le misurazioni confocali. Inoltre, la molecola di RNA può essere legata alle maniglie del DNA per aumentare la stabilità del legame.

Strategia di etichettatura finale
Il costrutto deve essere legato a perline tramite una forte interazione molecolare. Mentre ci sono approcci disponibili per il legame covalente delle maniglie alle ^perline46, interazioni forti ma non covalenti come streptavidina-biotina e digoxigenina-anticorpo sono comunemente usate negli esperimenti OT15,33,35,45. Nel protocollo descritto, il costrutto è etichettato con biotina o digossigenina e le perline sono rivestite rispettivamente con streptavidina o anticorpi contro la digossigenina (Figura 1A). Questo approccio sarebbe adatto per applicare forze fino a circa 60 pN (per tether)⁴⁷. Inoltre, l’uso di diverse strategie di etichettatura 5′ e 3′ consente di determinare l’orientamento del cavo formato tra le ^perline17.

Etichettatura delle proteine per misure di fluorescenza
Per l’imaging confocale, ci sono diversi approcci comunemente usati per l’etichettatura a fluorescenza. Ad esempio, i fluorofori possono essere attaccati covalentemente a residui di amminoacidi che si trovano nativamente nelle proteine o introdotti dalla mutagenesi diretta dal sito attraverso un gruppo organico reattivo. I coloranti tiolici o ammino-reattivi possono essere utilizzati per l’etichettatura dei residui di cisteina e lisina, rispettivamente. Esistono diversi metodi di protezione reversibili per aumentare la specificità dell’etichettatura48,49, tuttavia le proteine native sarebbero tipicamente etichettate a più residui. Sebbene le piccole dimensioni del fluoroforo possano conferire un vantaggio, l’etichettatura non specifica potrebbe interferire con l’attività proteica e quindi l’intensità del segnale potrebbe ^variare49. Inoltre, a seconda dell’efficienza di etichettatura, l’intensità del segnale può differire tra i diversi esperimenti. Pertanto, un controllo dell’attività deve essere eseguito prima dell’esperimento.

Nel caso in cui la proteina di interesse contenga un tag N- o C-terminale, come un His-tag o strep-tag, l’etichettatura specifica di questi tag rappresenta un altro approccio popolare. Inoltre, l’etichettatura mirata ai tag riduce la possibilità che il fluoroforo interferisca con l’attività proteica e può migliorare la ^{solubilità49}. Tuttavia, l’etichettatura specifica del tag di solito produce proteine marcate con monofluoroforo, che potrebbero essere difficili da rilevare. Un altro modo di etichettatura specifica può essere realizzato impiegando anticorpi.

Configurazione della microfluidica
La combinazione di OT con un sistema di microfluidica consente una rapida transizione tra diverse condizioni sperimentali. Inoltre, i sistemi di corrente sfruttano il mantenimento del flusso laminare all’interno della cella di flusso, che preclude la miscelazione di liquidi da altri canali nella direzione perpendicolare rispetto alla direzione del flusso. Pertanto, il flusso laminare è particolarmente vantaggioso per la progettazione sperimentale. Attualmente, le celle di flusso con un massimo di 5 canali sono comunemente utilizzate (Figura 3).