Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Die Übertragung genetischer Information von DNA auf Proteine durch mRNAs ist ein komplexer biochemischer Prozess, der auf allen Ebenen durch makromolekulare Interaktionen innerhalb von Zellen präzise reguliert wird. Für die translationale Regulation spielen RNA-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle, um schnell auf verschiedene Reize und Signale zu ^reagieren1,2. Einige RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen die mRNA-Stabilität und verändern dadurch die Zeit, in der eine RNA translational aktiv ist. Andere RNA-Protein-Interaktionen sind mit Rekodierungsmechanismen wie Stop-Codon-Readthrough, Bypassing oder Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 assoziiert. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Reihe von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit stimulierenden mRNA-Elementen und der Translationsmaschinerie interagieren, um zu bestimmen, wann und wie viel Rekodierung in der Zelle stattfinden wird7,8,9,10,11. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation und deren Modulation der RNA-Struktur und -Stabilität zu analysieren, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Interaktionsprinzipien und mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Proteinkomplexe im Detail zu untersuchen.

Jahrzehntelange Arbeit hat den Grundstein für die Untersuchung des mehrstufigen und mehrkomponentigen Prozesses der Translation gelegt, der auf einer komplizierten Kommunikation zwischen den RNA- und Proteinkomponenten der Translationsmaschinerie beruht, um Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erreichen12,13,14. Ein entscheidender nächster Schritt zum Verständnis komplexer regulatorischer Ereignisse ist die Bestimmung der Kräfte, Zeitskalen und strukturellen Determinanten während der Translation mit hoher Genauigkeit12,15,16,17. Die Untersuchung der RNA-Konformationsdynamik und insbesondere wie trans-wirkende Hilfsfaktoren während der Translation auf die RNA-Struktur wirken, wurde durch das Aufkommen von Einzelmolekülwerkzeugen, einschließlich optischer Pinzetten oder Nullmodus-Wellenleiter^{, weiter beleuchtet16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26}.

Optische Pinzetten (OT) stellen eine hochpräzise Einzelmolekültechnik dar, die angewendet wurde, um viele Arten von RNA-abhängigen dynamischen Prozessen einschließlich Transkription und Translation zu untersuchen26,27,28,29,30,31,32. Die Verwendung einer optischen Pinzette hat es ermöglicht, molekulare Wechselwirkungen, Nukleinsäurestrukturen und thermodynamische Eigenschaften, Kinetik und Energetik dieser Prozesse im Detail zu untersuchen16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Der optische Pinzetten-Assay basiert auf dem Einklemmen mikroskopischer Objekte mit einem fokussierten Laserstrahl. In einem typischen OT-Experiment wird das interessierende Molekül zwischen zwei transparenten (normalerweise Polystyrol-) Kügelchen gebunden (Abbildung 1A)²⁷. Diese Perlen werden dann von optischen Fallen aufgefangen, die sich wie Federn verhalten. So kann die auf das Molekül ausgeübte Kraft basierend auf der Verschiebung der Perle aus dem Zentrum des fokussierten Laserstrahls (Fallenzentrum) berechnet werden. Kürzlich wurden optische Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie kombiniert (Abbildung 1B), was Fluoreszenz- oder Förster-Resonanzenergietransfermessungen (FRET) ermöglicht40,41,42. Dies eröffnet ein völlig neues Feld möglicher Experimente, die eine gleichzeitige Messung und damit eine präzise Korrelation von Kraftspektroskopie und Fluoreszenzdaten ermöglichen.

Hier demonstrieren wir Experimente mit der optischen Pinzette in Kombination mit konfokaler Mikroskopie, um Protein-RNA-Interaktionen zu untersuchen, die die translationale Frameshifting regulieren. Zwischen objektiv und Kondensator ermöglicht eine Durchflusszelle mit fünf Kanälen eine kontinuierliche Probenapplikation mit laminarer Strömung. Durch die mikrofluidischen Kanäle können verschiedene Komponenten direkt injiziert werden, was die Hands-on-Zeit verkürzt und während des gesamten Experiments einen sehr geringen Probenverbrauch ermöglicht.

Zunächst wird eine grundlegende Richtlinie zur Unterstützung des Designs von OT-Experimenten vorgeschlagen und Vorteile sowie Fallstricke verschiedener Setups diskutiert. Als nächstes werden die Aufbereitung von Proben und experimentelle Workflows beschrieben und ein Protokoll für die Datenanalyse bereitgestellt. Um ein Beispiel darzustellen, skizzieren wir die Ergebnisse von RNA-Dehnungsexperimenten zur Untersuchung des SARS-CoV-2 frameshifting RNA-Elements (Abbildung 2A) mit dem trans-agierenden Faktor, der kurzen Isoform des antiviralen Zinkfingerproteins (ZAP), das die Translation der viralen RNA aus einem alternativen Leserahmen ^verändert43. Darüber hinaus wird gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte Ribosomen in diesem OT-konfokalen Assay verwendet werden können, was nützlich wäre, um die Prozessivität und Geschwindigkeit der Translationsmaschinerie zu überwachen. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Puffer, Liganden oder anderer zellulärer Komponenten schnell zu testen, um verschiedene Aspekte der Translation zu untersuchen. Schließlich werden häufige experimentelle Fallstricke und deren Behebung diskutiert. Im Folgenden werden einige entscheidende Punkte im experimentellen Design skizziert.

Konstruktionsdesign
Prinzipiell gibt es zwei gängige Ansätze, um ein OT-kompatibles RNA-Konstrukt zu erstellen. Der erste Ansatz verwendet ein langes RNA-Molekül, das mit komplementären DNA-Handles hybridisiert wird, wodurch ein Konstrukt aus zwei RNA/DNA-Hybridregionen entsteht, die eine einzelsträngige RNA-Sequenz in der Mitte flankieren (Abbildung 2B). Dieser Ansatz wird in den meisten OT-RNA-Experimenten verwendet33,44,45.

Der zweite Ansatz nutzt dsDNA-Griffe mit kurzen (ca. 20 nt) ^{Überhängen15,17}. Diese Überhänge werden dann mit dem RNA-Molekül hybridisiert. Obwohl komplizierter im Design, überwindet die Verwendung von dsDNA-Handles einige Einschränkungen des DNA / RNA-Hybridsystems. Prinzipiell können auch sehr lange Griffe (>10kb) realisiert werden, was für konfokale Messungen komfortabler ist. Darüber hinaus kann das RNA-Molekül an DNA-Handles ligiert werden, um die Tether-Stabilität zu erhöhen.

End-Labeling-Strategie
Das Konstrukt muss über eine starke molekulare Wechselwirkung an Perlen gebunden werden. Während es Ansätze für die kovalente Bindung von Griffen an ^Perlen46 gibt, werden starke, aber nicht-kovalente Wechselwirkungen wie Streptavidin-Biotin und Digoxigenin-Antikörper häufig in OT-Experimenten verwendet15,33,35,45. Im beschriebenen Protokoll wird das Konstrukt mit Biotin oder Digoxigenin markiert, und die Kügelchen sind mit Streptavidin bzw. Antikörpern gegen Digoxigenin beschichtet (Abbildung 1A). Dieser Ansatz wäre für die Anwendung von Kräften bis zu etwa 60 pN (per Tether)⁴⁷ geeignet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung unterschiedlicher 5′- und 3′-Markierungsstrategien die Bestimmung der Ausrichtung des zwischen den Kügelchen gebildeten ^Seils17.

Proteinmarkierung für Fluoreszenzmessungen
Für die konfokale Bildgebung gibt es mehrere häufig verwendete Ansätze zur Fluoreszenzmarkierung. Zum Beispiel können Fluorophore kovalent an Aminosäurereste gebunden sein, die nativ in Proteinen vorkommen oder durch ortsgerichtete Mutagenese durch eine reaktive organische Gruppe eingeführt werden. Thiol- oder Amin-reaktive Farbstoffe können zur Markierung von Cystein- bzw. Lysinresten verwendet werden. Es gibt mehrere reversible Schutzmethoden, um die Spezifität der Markierung zu ^{erhöhen48,49}, jedoch würden native Proteine typischerweise an mehreren Rückständen markiert. Obwohl die geringe Größe des Fluorophors einen Vorteil bieten kann, kann eine unspezifische Markierung die Proteinaktivität beeinträchtigen und somit die Signalintensität ^variieren49. Abhängig von der Markierungseffizienz kann die Signalintensität zwischen verschiedenen Experimenten variieren. Daher sollte vor dem Experiment eine Aktivitätsprüfung durchgeführt werden.

Falls das Protein von Interesse ein N- oder C-terminales Tag enthält, wie z. B. ein His-Tag oder ein Streptokokken-Tag, stellt die spezifische Kennzeichnung dieser Tags einen weiteren beliebten Ansatz dar. Darüber hinaus verringert die markierungsorientierte Markierung die Wahrscheinlichkeit, dass das Fluorophor die Proteinaktivität stört, und kann die Löslichkeit ^verbessern49. Die Tag-spezifische Markierung führt jedoch in der Regel zu monofluorophor markierten Proteinen, die schwer nachzuweisen sein können. Eine andere Möglichkeit der spezifischen Markierung kann durch den Einsatz von Antikörpern erreicht werden.

Aufbau der Mikrofluidik
Die Kombination von OT mit einem Mikrofluidik-System ermöglicht einen schnellen Übergang zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. Darüber hinaus nutzen Stromsysteme die Aufrechterhaltung der laminaren Strömung in der Durchflusszelle, was das Mischen von Flüssigkeiten aus anderen Kanälen in senkrechter Richtung relativ zur Strömungsrichtung verhindert. Daher ist die laminare Strömung besonders vorteilhaft für das experimentelle Design. Derzeit werden häufig Flusszellen mit bis zu 5 Kanälen eingesetzt (Abbildung 3).