CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması
Summary
Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.
Abstract
DNA’daki çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler) DNA hasarının en sitotoksik türüdür. Sayısız hakaret bu lezyonlara neden olabileceğinden (örneğin, replikasyon stresi, iyonlaştırıcı radyasyon, onarılmamış UV hasarı), DSB’ler her gün çoğu hücrede görülür. Hücre ölümüne ek olarak, onarılmamış DSB’ler genom bütünlüğünü azaltır ve ortaya çıkan mutasyonlar tümörigenezi tetikleyebilir. Bu riskler ve DSB’lerin prevalansı, hücrelerin bu lezyonları onarma mekanizmalarına yönelik araştırmaları motive etmektedir. Yeni nesil dizileme, DSB onarım kusurlarıyla ilişkili mutasyonları tam olarak tanımlamak için güçlü bir araç sağlamak üzere iyonlaştırıcı radyasyonla DSB’lerin indüksiyonu ile eşleştirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, iyonlaştırıcı radyasyonla ilişkili rastgele oluşan DSB’lerin onarımını tespit etmek için hesaplama açısından zorlu ve maliyet engelleyici tüm genom dizilemesini gerektirir. I-Sce1 gibi nadir kesici endonükleazlar, tek bir DSB üretme yeteneği sağlar, ancak tanıma bölgeleri ilgilenilen genoma yerleştirilmelidir. Sonuç olarak, onarım bölgesi doğal olarak yapaydır. Son gelişmeler, kılavuz RNA’nın (sgRNA) bir Cas9 endonükleazını ilgilenilen herhangi bir genom lokusuna yönlendirmesine izin vermektedir. Bu, Cas9 kaynaklı DSB’yi çevreleyen DNA’ya odaklanmasına izin vererek yeni nesil dizilemeyi daha uygun maliyetli hale getiren DSB onarımı çalışmasına uygulanabilir. Makalenin amacı, CD4 geninin bir DSB yukarı akışının onarımından kaynaklanan mutasyonları tanımlayabilen bir protokol sunarak bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermektir. Protokol, onarım inhibitörleri, viral protein ekspresyonu, mutasyonlar ve nispeten sınırlı hesaplama gereksinimlerine sahip çevresel maruziyetler gibi eksojen faktörlerle ilişkili DSB’nin mutajenik potansiyelindeki değişiklikleri belirlemek için uyarlanabilir. Bir organizmanın genomu dizilendikten sonra, bu yöntem teorik olarak herhangi bir genomik lokusta ve o organizmanın transfekte edilebilen herhangi bir hücre kültürü modelinde kullanılabilir. Yaklaşımın benzer uyarlamaları, aynı genetik arka plandaki farklı lokuslar arasındaki onarım sadakatinin karşılaştırılmasına izin verebilir.
Introduction
Genomik stabilitenin korunması, tüm canlı organizmalar için kritik öneme sahiptir. Doğru DNA replikasyonu ve sağlam bir DNA hasar yanıtı (DDR), genetik materyali sadık bir şekilde yaymak için gereklidir 1,2. DNA hasarları çoğu hücrede düzenli olarak meydana gelir 2,3. Bu hasarlar hissedildiğinde, hücre döngüsü ilerlemesi durdurulur ve DNA onarım mekanizmaları aktive edilir. DNA veya DSB’lerdeki çift iplikçik kırılmaları, DNA hasarının en toksik ve mutajenik türüdür 3,4.
Birkaç DDR sinyal yolu bu lezyonları onarabilirken, en iyi çalışılan DSB onarım yolları homolog rekombinasyon (HR) ve homolog olmayan uç birleştirmedir (NHEJ). HR, homolog bir şablon olarak kardeş kromatid kullanarak bir DSB’yi onaran büyük ölçüde hatasız bir yoldur. Bu, bir hücre döngüsünün S fazında ve G2 fazında 5,6,7 olma eğilimindedir. NHEJ hataya daha yatkındır, ancak hücre döngüsü 8,9 boyunca gerçekleşebilir. Belirli onarım mekanizmalarının verimliliğini ölçmek için çeşitli muhabir testleri geliştirilmiştir10,11,12. Bu tahliller, GFP veya mCherry’yi11,13 olarak kullanarak DSB onarım yolu aktivitesinin yüksek verim ölçümü için akış sitometrisine dayanma eğilimindedir. Son derece verimli olsalar da, yapay olarak tanıtılan bir DSB’de meydana gelen kanonik onarıma güvenirler.
DSB onarımını incelemek için kullanılan çeşitli başka yöntemler vardır. Bunların birçoğu immünofloresan (IF) mikroskopisi 1,14’e dayanmaktadır. IF mikroskopisi, DSB’ler genotoksik kimyasallara veya iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalarak indüklendikten sonra onarım komplekslerini temsil eden ayrı nükleer odakları tespit eder15,16. Bu odakların oluşumunu ve çözünürlüğünü izlemek, sırasıyla14,17 onarımın başlatılması ve tamamlanmasının bir göstergesidir. Bununla birlikte, bu DSB indüksiyon yöntemleri (yani, kimyasallar veya iyonlaştırıcı radyasyon), genomda tanımlanmış yerlerde DSB’lere neden olmaz. Ayrıca, bunları DSB’lerin yalnızca küçük bir sayısını (örneğin, 2-4) tutarlı bir şekilde indüklemek için kullanmak işlevsel olarak imkansızdır. Sonuç olarak, DSB’leri indüklemek için en sık kullanılan yöntemler, genom boyunca rastgele dağılmış çok sayıda lezyona neden olur18. Nadir kesen bir endonükleaz için tanıma bölgesi yerleştirilerek ve I-Sce119 gibi ilgili endonükleazı eksprese ederek az sayıda DSB tanıtılabilir. Ne yazık ki, bir hedef bölgenin gerekli entegrasyonu, DSB’nin endojen genomik lokuslarda incelenmesini önler.
Bu makalede, kullanıcı tanımlı bir lokusta üretilen bir DSB’nin onarımı ile ilişkili mutasyonları tespit etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir viral proteinin bir DSB ile ilişkili mutasyon sayısını artırma yeteneğini değerlendirmek için uygulanan yaklaşımın temsili bir örneğini sunuyoruz. Spesifik olarak, bu makalede, vektör kontrolünü ifade eden insan sünnet derisi keratinositlerinde (HFK LXSN) ve insan papilloma virüsü tip 8’in (HFK 8E6) E6 proteinini eksprese eden HFK’da insan CD4 açık okuma çerçevesinde bir DSB’yi indüklemek için bir CAS9 endonükleazını yönlendirmek için tek bir kılavuz RNA’nın (sgRNA) kullanımı açıklanmaktadır. Kırılmayı çevreleyen bölgenin hedefli yeni nesil dizilimi (NGS), lezyonun onarımı ile ilişkili mutasyonların titizlikle tanımlanmasını sağlar. Bu veriler, viral proteinin DSB onarımı sırasında mutasyonlarda yaklaşık 20 kat artışa neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tüm genom dizilemesine gerek kalmadan tek bir lokusta DSB’lerin mutajenik sonuçlarının tarafsız bir karakterizasyonunu sağlar. Prensip olarak, protokol, genom lokusları veya hücre hatları arasındaki göreceli mutasyon riskini karşılaştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sağlanan bilgilerin derinliğine ek olarak, bu yöntemin birkaç avantajı vardır. İlk olarak, DSB onarımı, teoride, ilgili hücrenin genomunu değiştirmeden herhangi bir genomik lokusta değerlendirilebilir. İkincisi, onarımın NGS analizine erişim, tanımlanmış bir alanı hedefleyen tek bir DSB’nin yapılması ve analiz edilmesinin sağladığı düşük maliyet ve hesaplama çabası ile arttırılır. Son olarak, ek organizmaların genomlarının rutin olarak kullanılabilir hale gelmesi ve çeşitli memeli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makalede bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (P20GM130448) (NAW ve RP) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI R15 CA242057 01A1); Kansas Eyalet Üniversitesi’ndeki Johnson Kanser Araştırma Merkezi; ve ABD Savunma Bakanlığı (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). KSU-CVM Konfokal Çekirdek ve Joel Sanannem’e immünofloresan mikroskopimiz için teşekkür ederiz. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve bu finansman kuruluşlarının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
