Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Manter a estabilidade genômica é fundamental para todos os organismos vivos. A replicação precisa do DNA e uma resposta robusta de dano de DNA (DDR) são necessárias para propagar fielmente o material genético ^1,2. Os danos no DNA ocorrem regularmente na maioria das células ^2,3. Quando esses danos são sentidos, a progressão do ciclo celular é interrompida, e os mecanismos de reparação do DNA são ativados. Quebras duplas de fios no DNA ou DSBs são o tipo mais tóxico e mutagênico de dano de DNA ^3,4.

Embora várias vias de sinalização DDR possam reparar essas lesões, as vias de reparo DSB mais estudadas são a recombinação homologous (RH) e a junção final não homóloga (NHEJ). O RH é um caminho em grande parte livre de erros que repara um DSB usando um cromátide irmã como modelo homólogo. Isso tende a acontecer na fase S e G2 de um ciclo^{celular 5,6,7}. O NHEJ é mais propenso a erros, mas pode acontecer ao longo do ciclo^{celular 8,9}. Vários ensaios de repórteres foram desenvolvidos para medir a eficiência de mecanismos específicos de reparo 10,11,12. Esses ensaios tendem a depender da citometria de fluxo para uma medição de alto rendimento da atividade da via de reparo DSB usando GFP ou mCherry como leitura^11,13. Embora altamente eficientes, eles dependem de reparos canônicos que ocorrem em um DSB artificialmente introduzido.

Há uma variedade de outros métodos usados para estudar o reparo do DSB. Muitos deles dependem da microscopia de imunofluorescência (IF) ^1,14. Se a microscopia detectar focos nucleares discretos representativos de complexos de reparo após os DSBs serem induzidos pela exposição a produtos químicos genotoxicos ou radiação ionizante^15,16. O acompanhamento da formação e resolução desses focos fornece uma indicação de iniciação e conclusão do reparo, respectivamente^14,17. No entanto, esses métodos de indução de DSB (ou seja, produtos químicos ou radiação ionizante) não causam DSBs em locais definidos no genoma. Também é funcionalmente impossível usá-los para induzir consistentemente apenas um pequeno número (por exemplo, 2-4) de DSBs. Como resultado, os métodos mais comumente utilizados de induzir DSBs causam uma infinidade de lesões distribuídas aleatoriamente ao longo do genoma¹⁸. Um pequeno número de DSBs pode ser introduzido inserindo o local de reconhecimento de uma endonuclease de corte raro e expressando a endonuclease pertinente, como o I-Sce1¹⁹. Infelizmente, a necessária integração de um local de destino impede o exame de DSB em loci genômico endógeno.

Este manuscrito descreve um método para detectar mutações associadas ao reparo de um DSB gerado em um lócus definido pelo usuário. Fornecemos um exemplo representativo da abordagem aplicada para avaliar a capacidade de uma proteína viral de aumentar o número de mutações associadas a um DSB. Especificamente, este manuscrito descreve o uso de um único guia RNA (sgRNA) para direcionar uma endonuclease CAS9 para induzir um DSB no quadro de leitura aberta CD4 humano em queratinócitos de prepúcio humano expressando controle vetorial (HFK LXSN) e HFK que expressa a proteína E6 do vírus papiloma humano tipo 8 (HFK 8E6). O sequenciamento de última geração (NGS) da região em torno do rompimento permite que mutações associadas à reparação da lesão sejam rigorosamente definidas. Esses dados demonstram que a proteína viral causa um aumento de aproximadamente 20 vezes nas mutações durante o reparo do DSB. Também fornece uma caracterização imparcial das consequências mutagênicas dos DSBs em um único lócus sem a necessidade de sequenciamento de genoma inteiro. Em princípio, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para comparar o risco relativo de mutações entre loci genoma ou linhas celulares.