次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

ゲノムの安定性を維持することは、すべての生物にとって非常に重要です。正確なDNA複製と堅牢なDNA損傷応答(DDR)は、遺伝物質を忠実に伝播するために必要である^1,2。DNA損傷は、ほとんどの細胞で定期的に起こる^2,3。これらの損傷が感知されると、細胞周期の進行が止まり、DNA修復機構が活性化される。DNAまたはDSBの二本鎖切断は、DNA損傷の中で最も有毒で変異原性のあるタイプである^3,4。

いくつかのDDRシグナル伝達経路がこれらの病変を修復することができるが、最も徹底的に研究されたDSB修復経路は相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)である。HRは、姉妹染色分体を相同テンプレートとして使用してDSBを修復する、ほとんどエラーのない経路です。これは、細胞周期⁵、^6、7のS期およびG2期において起こる傾向がある。NHEJはよりエラーが発生しやすいが、細胞周期全体を通して起こり得る^8,9。特異的修復機構の効率を測定するために様々なレポーターアッセイが開発されている10、^11、12。これらのアッセイは、GFPまたはmCherryを読み出しとして用いたDSB修復経路活性のハイスループット測定のためにフローサイトメトリーに依存する傾向がある^11、13。非常に効率的ですが、人工的に導入されたDSBで発生する標準的な修復に依存しています。

DSB修復を研究するために使用される他の様々な方法があります。これらの多くは、免疫蛍光(IF)顕微鏡^1,14に依存している。IF顕微鏡は、DSBが遺伝毒性化学物質または電離放射線への曝露によって誘導された後の修復複合体を代表する離散核病巣を検出する^15,16。これらの病巣の形成および解決を追跡することは、それぞれ修復の開始および完了の指標を提供する^14、17。しかしながら、DSB誘導のこれらの方法(すなわち、化学物質または電離放射線)は、ゲノム中の定義された位置でDSBを引き起こさない。また、それらを使用して、少数のDSBのみ(例えば、2〜4個)のみを一貫して誘導することも機能的に不可能である。その結果、DSBを誘導する最も一般的に使用される方法は、ゲノム全体にランダムに分布する多数の病変を引き起こす¹⁸。希少切断エンドヌクレアーゼの認識部位を挿入し、I-Sce1¹⁹などの適切なエンドヌクレアーゼを発現させることにより、少数のDSBを導入することができる。残念なことに、標的部位の必要な統合は、内因性ゲノム遺伝子座におけるDSBの検査を妨げる。

本稿では、ユーザ定義遺伝子座で発生したDSBの修復に関連する変異を検出する方法を記載する。我々は、DSBに関連する変異の数を増加させるウイルスタンパク質の能力を評価するために適用されるアプローチの代表例を提供する。具体的には、この原稿は、ヒト包皮ケラチノサイトにおけるヒトCD4オープンリーディングフレームでDSBを誘導するためにCAS9エンドヌクレアーゼを指示するための単一のガイドRNA(sgRNA)の使用を記載するベクターコントロール(HFK LXSN)およびヒトパピローマウイルス8型(HFK 8E6)のE6タンパク質を発現するHFKを発現する。ブレークを取り囲む領域の標的次世代シーケンシング(NGS)は、病変の修復に関連する変異を厳密に定義することを可能にする。これらのデータは、ウイルスタンパク質がDSB修復中に変異の約20倍の増加を引き起こすことを実証している。また、全ゲノムシーケンシングを必要とせずに、単一の遺伝子座におけるDSBの変異原性の影響を偏りなく特徴付けます。原則として、このプロトコルは、ゲノム遺伝子座または細胞株間の突然変異の相対リスクを比較するために容易に適合させることができる。