Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4
Summary
Qui viene presentata l’endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.
Abstract
Le rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA sono il tipo più citotossico di danno al DNA. Poiché una miriade di insulti può causare queste lesioni (ad esempio, stress di replicazione, radiazioni ionizzanti, danni UV non riparati), i DSB si verificano nella maggior parte delle cellule ogni giorno. Oltre alla morte cellulare, i DSB non riparati riducono l’integrità del genoma e le mutazioni risultanti possono guidare la tumorigenesi. Questi rischi e la prevalenza di DSB motivano le indagini sui meccanismi con cui le cellule riparano queste lesioni. Il sequenziamento di nuova generazione può essere abbinato all’induzione di DSB mediante radiazioni ionizzanti per fornire un potente strumento per definire con precisione le mutazioni associate ai difetti di riparazione del DSB. Tuttavia, questo approccio richiede un sequenziamento dell’intero genoma computazionalmente impegnativo e proibitivo per rilevare la riparazione dei DSB che si verificano casualmente associati alle radiazioni ionizzanti. Rare endonucleasi da taglio, come I-Sce1, forniscono la capacità di generare un singolo DSB, ma i loro siti di riconoscimento devono essere inseriti nel genoma di interesse. Di conseguenza, il sito di riparazione è intrinsecamente artificiale. Recenti progressi consentono all’RNA guida (sgRNA) di dirigere un’endonucleasi Cas9 a qualsiasi locus del genoma di interesse. Questo potrebbe essere applicato allo studio della riparazione del DSB rendendo il sequenziamento di prossima generazione più conveniente consentendo di concentrarsi sul DNA che fiancheggia il DSB indotto da Cas9. L’obiettivo del manoscritto è dimostrare la fattibilità di questo approccio presentando un protocollo in grado di definire mutazioni che derivano dalla riparazione di un DSB a monte del gene CD4. Il protocollo può essere adattato per determinare i cambiamenti nel potenziale mutageno del DSB associati a fattori esogeni, come inibitori di riparazione, espressione proteica virale, mutazioni ed esposizioni ambientali con requisiti di calcolo relativamente limitati. Una volta che il genoma di un organismo è stato sequenziato, questo metodo può essere teoricamente impiegato in qualsiasi locus genomico e in qualsiasi modello di coltura cellulare di quell’organismo che può essere trasfettato. Adattamenti simili dell’approccio potrebbero consentire confronti di fedeltà di riparazione tra diversi loci nello stesso background genetico.
Introduction
Mantenere la stabilità genomica è fondamentale per tutti gli organismi viventi. Una replicazione accurata del DNA e una robusta risposta al danno del DNA (DDR) sono necessarie per propagare fedelmente il materiale genetico 1,2. I danni al DNA si verificano regolarmente nella maggior parte delle cellule 2,3. Quando questi danni vengono rilevati, la progressione del ciclo cellulare viene interrotta e vengono attivati i meccanismi di riparazione del DNA. Le rotture a doppio filamento nel DNA o nei DSB sono il tipo più tossico e mutageno di danno al DNA 3,4.
Mentre diverse vie di segnalazione DDR possono riparare queste lesioni, le vie di riparazione DSB più studiate sono la ricombinazione omologa (HR) e l’unione finale non omologa (NHEJ). HR è un percorso in gran parte privo di errori che ripara un DSB utilizzando un cromatide gemello come modello omologo. Questo tende ad accadere nella fase S e nella fase G2 di un ciclo cellulare 5,6,7. NHEJ è più soggetto a errori, ma può accadere durante il ciclo cellulare 8,9. Sono stati sviluppati vari saggi reporter per misurare l’efficienza di specifici meccanismi di riparazione 10,11,12. Questi saggi tendono a fare affidamento sulla citometria a flusso per una misurazione ad alto rendimento dell’attività del percorso di riparazione del DSB utilizzando GFP o mCherry come lettura11,13. Sebbene altamente efficienti, si basano sulla riparazione canonica che si verifica in un DSB introdotto artificialmente.
Ci sono una varietà di altri metodi utilizzati per studiare la riparazione DSB. Molti di questi si basano sulla microscopia a immunofluorescenza (IF) 1,14. La microscopia IF rileva focolai nucleari discreti rappresentativi di complessi di riparazione dopo che i DSB sono indotti dall’esposizione a sostanze chimiche genotossiche o radiazioni ionizzanti15,16. Tracciare la formazione e la risoluzione di questi fuochi fornisce un’indicazione di inizio e completamento della riparazione, rispettivamente14,17. Tuttavia, questi metodi di induzione del DSB (cioè sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti) non causano DSB in posizioni definite nel genoma. È anche funzionalmente impossibile usarli per indurre costantemente solo un piccolo numero (ad esempio, 2-4) di DSB. Di conseguenza, i metodi più comunemente usati per indurre i DSB causano una moltitudine di lesioni distribuite casualmente in tutto il genoma18. Un piccolo numero di DSB può essere introdotto inserendo il sito di riconoscimento per un’endonucleasi rara ed esprimendo l’endonucleasi pertinente, come I-Sce119. Sfortunatamente, l’integrazione richiesta di un sito target impedisce l’esame del DSB in loci genomici endogeni.
Questo manoscritto descrive un metodo per rilevare le mutazioni associate alla riparazione di un DSB generato in un luogo definito dall’utente. Forniamo un esempio rappresentativo dell’approccio applicato per valutare la capacità di una proteina virale di aumentare il numero di mutazioni associate a un DSB. In particolare, questo manoscritto descrive l’uso di un singolo RNA guida (sgRNA) per dirigere un’endonucleasi CAS9 per indurre un DSB al frame di lettura aperto CD4 umano nei cheratinociti del prepuzio umano che esprimono il controllo vettoriale (HFK LXSN) e HFK che esprime la proteina E6 del virus del papilloma umano di tipo 8 (HFK 8E6). Il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) della regione circostante la rottura consente di definire rigorosamente le mutazioni associate alla riparazione della lesione. Questi dati dimostrano che la proteina virale provoca un aumento di circa 20 volte delle mutazioni durante la riparazione del DSB. Fornisce inoltre una caratterizzazione imparziale delle conseguenze mutagene dei DSB in un singolo locus senza la necessità di sequenziamento dell’intero genoma. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per confrontare il rischio relativo di mutazioni tra loci del genoma o linee cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oltre alla profondità delle informazioni fornite, ci sono diversi vantaggi in questo metodo. In primo luogo, la riparazione DSB, in teoria, può essere valutata in qualsiasi loci genomico senza modificare il genoma della cellula di interesse. In secondo luogo, l’accesso all’analisi NGS della riparazione è aumentato dal costo ridotto e dallo sforzo computazionale offerto dalla creazione e dall’analisi di un singolo DSB mirato a un’area definita. Infine, con i genomi di altri organismi che diventano regolarmente disponib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW e RP); National Cancer Institute del National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center presso la Kansas State University; e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Apprezziamo KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman per la nostra microscopia a immunofluorescenza. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di queste agenzie di finanziamento.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
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