Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind
Summary
Hier wird das sgRNA/CAS9-Endonuklease- und Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um die Mutationen zu identifizieren, die mit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind.
Abstract
Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA sind die zytotoxischste Art von DNA-Schäden. Da eine Vielzahl von Beleidigungen zu diesen Läsionen führen können (z. B. Replikationsstress, ionisierende Strahlung, nicht reparierte UV-Schäden), treten DSBs jeden Tag in den meisten Zellen auf. Zusätzlich zum Zelltod reduzieren nicht reparierte DSBs die Genomintegrität und die daraus resultierenden Mutationen können die Tumorgenese vorantreiben. Diese Risiken und die Prävalenz von DSBs motivieren zu Untersuchungen der Mechanismen, mit denen Zellen diese Läsionen reparieren. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann mit der Induktion von DSBs durch ionisierende Strahlung gepaart werden, um ein leistungsfähiges Werkzeug zur genauen Definition der Mutationen bereitzustellen, die mit DSB-Reparaturdefekten verbunden sind. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine rechenintensive und kostenintensive Sequenzierung des gesamten Genoms, um die Reparatur der zufällig auftretenden DSBs im Zusammenhang mit ionisierender Strahlung nachzuweisen. Seltene Schneideendonukleasen wie I-Sce1 bieten die Möglichkeit, ein einzelnes DSB zu erzeugen, aber ihre Erkennungsstellen müssen in das Genom von Interesse eingefügt werden. Infolgedessen ist der Ort der Reparatur von Natur aus künstlich. Jüngste Fortschritte ermöglichen es der Guide-RNA (sgRNA), eine Cas9-Endonuklease an jeden Genomort von Interesse zu leiten. Dies könnte auf die Untersuchung der DSB-Reparatur angewendet werden, die die Sequenzierung der nächsten Generation kostengünstiger macht, indem sie sich auf die DNA konzentriert, die das Cas9-induzierte DSB flankiert. Ziel des Manuskripts ist es, die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, indem ein Protokoll vorgestellt wird, das Mutationen definieren kann, die aus der Reparatur eines DSB vor dem CD4-Gen stammen. Das Protokoll kann angepasst werden, um Veränderungen des mutagenen Potenzials von DSB zu bestimmen, die mit exogenen Faktoren wie Reparaturinhibitoren, viraler Proteinexpression, Mutationen und Umweltexpositionen mit relativ begrenzten Rechenanforderungen verbunden sind. Sobald das Genom eines Organismus sequenziert wurde, kann diese Methode theoretisch an jedem genomischen Ort und in jedem Zellkulturmodell dieses Organismus, der transfiziert werden kann, angewendet werden. Ähnliche Anpassungen des Ansatzes könnten Vergleiche der Reparaturtreue zwischen verschiedenen Loci im selben genetischen Hintergrund ermöglichen.
Introduction
Die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist für alle lebenden Organismen von entscheidender Bedeutung. Eine genaue DNA-Replikation und eine robuste DNA-Schadensantwort (DDR) sind notwendig, um das genetische Material originalgetreu zu verbreiten 1,2. DNA-Schäden treten in den meisten Zellen regelmäßigauf 2,3. Wenn diese Schäden erkannt werden, wird der Zellzyklusverlauf gestoppt und DNA-Reparaturmechanismen aktiviert. Doppelstrangbrüche in DNA oder DSBs sind die giftigste und mutagenste Art von DNA-Schäden 3,4.
Während mehrere DDR-Signalwege diese Läsionen reparieren können, sind die am gründlichsten untersuchten DSB-Reparaturwege homologe Rekombination (HR) und nicht-homologe Endverbindung (NHEJ). HR ist ein weitgehend fehlerfreier Weg, der eine DSB mit einer Schwesterchromatide als homologe Vorlage repariert. Dies geschieht tendenziell in der S- und G2-Phase eines Zellzyklus 5,6,7. NHEJ ist fehleranfälliger, kann aber während des gesamten Zellzyklusauftreten 8,9. Verschiedene Reporter-Assays wurden entwickelt, um die Effizienz spezifischer Reparaturmechanismen zu messen10,11,12. Diese Assays stützen sich in der Regel auf die Durchflusszytometrie für eine Hochdurchsatzmessung der DSB-Reparaturpfadaktivität unter Verwendung von GFP oder mCherry als Auslesung11,13. Obwohl sie sehr effizient sind, verlassen sie sich auf eine kanonische Reparatur, die bei einem künstlich eingeführten DSB auftritt.
Es gibt eine Vielzahl anderer Methoden, die verwendet werden, um die DSB-Reparatur zu untersuchen. Viele davon beruhen auf Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) 1,14. Die IF Mikroskopie weist diskrete Kernherde nach, die für Reparaturkomplexe repräsentativ sind, nachdem DSBs durch Exposition gegenüber genotoxischen Chemikalien oder ionisierender Strahlung induziert wurden15,16. Die Verfolgung der Bildung und Auflösung dieser Herde liefert einen Hinweis auf die Einleitung bzw. den Abschluss der Reparatur14,17. Diese Methoden der DSB-Induktion (d.h. Chemikalien oder ionisierende Strahlung) verursachen jedoch keine DSBs an definierten Stellen im Genom. Es ist auch funktional unmöglich, sie zu verwenden, um konsistent nur eine kleine Anzahl (z. B. 2-4) von DSBs zu induzieren. Infolgedessen verursachen die am häufigsten verwendeten Methoden zur Induktion von DSBs eine Vielzahl von Läsionen, die zufällig im gesamten Genom verteiltsind 18. Eine kleine Anzahl von DSBs kann eingeführt werden, indem die Erkennungsstelle für eine Endonuklease mit seltenem Schneiden eingefügt und die entsprechende Endonuklease wie I-Sce119 ausgedrückt wird. Leider verhindert die erforderliche Integration eines Zielortes die Untersuchung von DSB an endogenen genomischen Loci.
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Erkennung von Mutationen, die mit der Reparatur eines an einem benutzerdefinierten Ort generierten DSB verbunden sind. Wir liefern ein repräsentatives Beispiel für den Ansatz, der angewendet wird, um die Fähigkeit eines viralen Proteins zu bewerten, die Anzahl der mit einem DSB assoziierten Mutationen zu erhöhen. Insbesondere beschreibt dieses Manuskript die Verwendung einer Single-Guide-RNA (sgRNA), um eine CAS9-Endonuklease anzuordnen, um einen DSB bei menschlichem CD4-offenem Leserahmen in menschlichen Vorhautkeratinozyten zu induzieren, die Vektorkontrolle (HFK LXSN) exprimieren, und HFK, das das E6-Protein des humanen Papillomavirus Typ 8 (HFK 8E6) exprimiert. Gezielte Next-Generation-Sequenzierung (NGS) der Region, die den Bruch umgibt, ermöglicht es, Mutationen, die mit der Reparatur der Läsion verbunden sind, streng zu definieren. Diese Daten zeigen, dass das virale Protein während der DSB-Reparatur einen etwa 20-fachen Anstieg der Mutationen verursacht. Es bietet auch eine unvoreingenommene Charakterisierung der mutagenen Folgen von DSBs an einem einzigen Ort, ohne dass eine Sequenzierung des gesamten Genoms erforderlich ist. Prinzipiell könnte das Protokoll leicht angepasst werden, um das relative Risiko von Mutationen zwischen Genomloci oder Zelllinien zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neben der Tiefe der bereitgestellten Informationen bietet diese Methode mehrere Vorteile. Erstens kann die DSB-Reparatur theoretisch an jedem genomischen Loci beurteilt werden, ohne das Genom der interessierenden Zelle zu verändern. Zweitens wird der Zugang zur NGS-Analyse der Reparatur durch die reduzierten Kosten und den geringeren Rechenaufwand erhöht, die durch die Erstellung und Analyse eines einzelnen DSB für einen definierten Bereich erforderlich sind. Da die Genome zusätzlicher Organismen routinemäßig verf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW und RP) unterstützt; Nationales Krebsinstitut der National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center an der Kansas State University; und dem US-Verteidigungsministerium (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Wir danken KSU-CVM Confocal Core und Joel Sanneman für unsere Immunfluoreszenzmikroskopie. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung dieser Förderagenturen dar.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
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