Utilisation du séquençage de nouvelle génération pour identifier les mutations associées à la réparation d’une rupture double brin induite par CAS9 près du promoteur CD4
Summary
Présenté ici est sgRNA/CAS9 endonucléase et protocole de séquençage de nouvelle génération qui peut être utilisé pour identifier les mutations associées à la réparation de rupture double brin près du promoteur CD4.
Abstract
Les cassures double brin (DSB) dans l’ADN sont le type de dommage à l’ADN le plus cytotoxique. Parce qu’une myriade d’insultes peuvent entraîner ces lésions (par exemple, stress de réplication, rayonnements ionisants, dommages UV non réparés), les DSB se produisent dans la plupart des cellules chaque jour. En plus de la mort cellulaire, les DSB non réparés réduisent l’intégrité du génome et les mutations qui en résultent peuvent conduire à la tumorigenèse. Ces risques et la prévalence des DSB motivent les recherches sur les mécanismes par lesquels les cellules réparent ces lésions. Le séquençage de nouvelle génération peut être associé à l’induction de DSB par rayonnement ionisant pour fournir un outil puissant permettant de définir avec précision les mutations associées aux défauts de réparation des DSB. Cependant, cette approche nécessite un séquençage du génome entier difficile sur le plan informatique et d’un coût prohibitif pour détecter la réparation des DSB aléatoires associés aux rayonnements ionisants. Les endonucléases coupantes rares, telles que I-Sce1, permettent de générer un seul DSB, mais leurs sites de reconnaissance doivent être insérés dans le génome d’intérêt. En conséquence, le site de réparation est intrinsèquement artificiel. Des avancées récentes permettent à l’ARN guide (ARNg) de diriger une endonucléase Cas9 vers n’importe quel locus du génome d’intérêt. Cela pourrait être appliqué à l’étude de la réparation du DSB rendant le séquençage de nouvelle génération plus rentable en lui permettant de se concentrer sur l’ADN flanquant le DSB induit par Cas9. L’objectif du manuscrit est de démontrer la faisabilité de cette approche en présentant un protocole permettant de définir des mutations issues de la réparation d’un DSB en amont du gène CD4. Le protocole peut être adapté pour déterminer les changements dans le potentiel mutagène du DSB associés à des facteurs exogènes, tels que les inhibiteurs de réparation, l’expression des protéines virales, les mutations et les expositions environnementales avec des exigences de calcul relativement limitées. Une fois que le génome d’un organisme a été séquencé, cette méthode peut théoriquement être utilisée à n’importe quel locus génomique et dans n’importe quel modèle de culture cellulaire de cet organisme qui peut être transfecté. Des adaptations similaires de l’approche pourraient permettre des comparaisons de la fidélité de réparation entre différents loci dans le même fond génétique.
Introduction
Le maintien de la stabilité génomique est essentiel pour tous les organismes vivants. Une réplication précise de l’ADN et une réponse robuste aux dommages à l’ADN (DDR) sont nécessaires pour propager fidèlement le matériel génétique 1,2. Les dommages à l’ADN se produisent régulièrement dans la plupart des cellules 2,3. Lorsque ces dommages sont détectés, la progression du cycle cellulaire est arrêtée et les mécanismes de réparation de l’ADN sont activés. Les ruptures double brin dans l’ADN ou les DSB sont le type de dommages à l’ADN le plus toxique et le plus mutagène 3,4.
Alors que plusieurs voies de signalisation DDR peuvent réparer ces lésions, les voies de réparation DSB les plus étudiées sont la recombinaison homologue (HR) et l’assemblage final non homologue (NHEJ). HR est une voie largement sans erreur qui répare un DSB en utilisant une chromatide sœur comme modèle homologue. Cela a tendance à se produire dans la phase S et la phase G2 d’un cycle cellulaire 5,6,7. NhEJ est plus sujet aux erreurs, mais cela peut se produire tout au long du cycle cellulaire 8,9. Divers essais de rapporteur ont été mis au point pour mesurer l’efficacité de mécanismes de réparation spécifiques 10,11,12. Ces essais ont tendance à s’appuyer sur la cytométrie en flux pour une mesure à haut débit de l’activité de la voie de réparation DSB en utilisant GFP ou mCherry comme lecture11,13. Bien que très efficaces, ils reposent sur une réparation canonique se produisant dans un DSB introduit artificiellement.
Il existe une variété d’autres méthodes utilisées pour étudier la réparation DSB. Beaucoup d’entre eux reposent sur la microscopie par immunofluorescence (FI) 1,14. La microscopie IF détecte des foyers nucléaires discrets représentatifs des complexes de réparation après que les DSB sont induits par l’exposition à des produits chimiques génotoxiques ou àdes rayonnements ionisants 15,16. Le suivi de la formation et de la résolution de ces foyers fournit une indication du début et de l’achèvement des réparations, respectivement14,17. Cependant, ces méthodes d’induction du DSB (c.-à-d. les produits chimiques ou les rayonnements ionisants) ne causent pas de DSB à des endroits définis du génome. Il est également fonctionnellement impossible de les utiliser pour induire systématiquement seulement un petit nombre (par exemple, 2-4) de DSB. En conséquence, les méthodes les plus couramment utilisées pour induire les DSB provoquent une multitude de lésions réparties aléatoirement dans tout le génome18. Un petit nombre d’ADB peut être introduit en insérant le site de reconnaissance d’une endonucléase coupant rare et en exprimant l’endonucléase pertinente, telle que I-Sce119. Malheureusement, l’intégration requise d’un site cible empêche l’examen du DSB aux loci génomiques endogènes.
Ce manuscrit décrit une méthode pour détecter les mutations associées à la réparation d’un DSB généré à un locus défini par l’utilisateur. Nous fournissons un exemple représentatif de l’approche appliquée pour évaluer la capacité d’une protéine virale à augmenter le nombre de mutations associées à un DSB. Plus précisément, ce manuscrit décrit l’utilisation d’un ARN guide unique (ARNg) pour diriger une endonucléase CAS9 afin d’induire un DSB au cadre de lecture ouvert CD4 humain dans les kératinocytes du prépuce humain exprimant la lutte antivectorielle (HFK LXSN) et HFK qui exprime la protéine E6 du virus du papillome humain de type 8 (HFK 8E6). Le séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS) de la région entourant la cassure permet de définir rigoureusement les mutations associées à la réparation de la lésion. Ces données démontrent que la protéine virale provoque une augmentation d’environ 20 fois des mutations pendant la réparation du DSB. Il fournit également une caractérisation impartiale des conséquences mutagènes des DSB à un seul locus sans avoir besoin d’un séquençage du génome entier. En principe, le protocole pourrait être facilement adapté pour comparer le risque relatif de mutations entre les loci du génome ou les lignées cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
En plus de la profondeur des informations fournies, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, la réparation DSB, en théorie, peut être évaluée à n’importe quel loci génomique sans modifier le génome de la cellule d’intérêt. Deuxièmement, l’accès à l’analyse NGS de la réparation est accru par la réduction des coûts et des efforts de calcul offerts par la création et l’analyse d’un seul DSB ciblé sur une zone définie. Enfin, étant donné que les génomes d’organismes su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches rapportées dans ce manuscrit ont été soutenues par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW et RP); Institut national du cancer des National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center à l’Université d’État du Kansas; et le département de la Défense des États-Unis (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Nous apprécions KSU-CVM Confocal Core et Joel Sanneman pour notre microscopie à immunofluorescence. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de ces organismes de financement.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
