Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor
Summary
Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.
Abstract
Dubbelstrengsbreuken (DSB’s) in DNA zijn de meest cytotoxische vorm van DNA-schade. Omdat een groot aantal beledigingen kan resulteren in deze laesies (bijv. Replicatiestress, ioniserende straling, niet-herstelde UV-schade), komen DSB’s elke dag in de meeste cellen voor. Naast celdood verminderen niet-herstelde DSB’s de genoomintegriteit en de resulterende mutaties kunnen tumorigenese stimuleren. Deze risico’s en de prevalentie van DSB’s motiveren onderzoek naar de mechanismen waarmee cellen deze laesies herstellen. Next generation sequencing kan worden gecombineerd met de inductie van DSB’s door ioniserende straling om een krachtig hulpmiddel te bieden om de mutaties geassocieerd met DSB-reparatiedefecten nauwkeurig te definiëren. Deze aanpak vereist echter computationeel uitdagende en onbetaalbare whole genome sequencing om de reparatie van de willekeurig voorkomende DSB’s geassocieerd met ioniserende straling te detecteren. Zeldzame snijdende endonucleasen, zoals I-Sce1, bieden de mogelijkheid om een enkele DSB te genereren, maar hun herkenningsplaatsen moeten in het genoom van belang worden ingevoegd. Als gevolg hiervan is de plaats van reparatie inherent kunstmatig. Recente ontwikkelingen maken het mogelijk om gids-RNA (sgRNA) een Cas9-endonuclease naar elke genoomlocus van belang te sturen. Dit kan worden toegepast op de studie van DSB-reparatie waardoor sequencing van de volgende generatie kosteneffectiever wordt door het mogelijk te maken dat het wordt gericht op het DNA dat de Cas9-geïnduceerde DSB flankeert. Het doel van het manuscript is om de haalbaarheid van deze aanpak aan te tonen door een protocol te presenteren dat mutaties kan definiëren die voortkomen uit het herstel van een DSB stroomopwaarts van het CD4-gen. Het protocol kan worden aangepast om veranderingen in het mutagene potentieel van DSB geassocieerd met exogene factoren te bepalen, zoals reparatieremmers, virale eiwitexpressie, mutaties en omgevingsblootstellingen met relatief beperkte berekeningsvereisten. Zodra het genoom van een organisme is gesequenced, kan deze methode theoretisch worden gebruikt op elke genomische locus en in elk celkweekmodel van dat organisme dat kan worden getransfecteerd. Vergelijkbare aanpassingen van de aanpak zouden vergelijkingen van reparatiegetrouwheid tussen verschillende loci met dezelfde genetische achtergrond mogelijk kunnen maken.
Introduction
Het handhaven van genomische stabiliteit is van cruciaal belang voor alle levende organismen. Nauwkeurige DNA-replicatie en een robuuste DNA damage response (DDR) zijn nodig om het genetisch materiaalgetrouw te vermeerderen 1,2. DNA-schade komt in de meeste cellen regelmatig voor 2,3. Wanneer deze schade wordt waargenomen, wordt de progressie van de celcyclus gestopt en worden DNA-reparatiemechanismen geactiveerd. Dubbelstrengsbreuken in DNA of DSB’s zijn de meest toxische en mutagene vorm van DNA-schade 3,4.
Hoewel verschillende DDR-signaleringsroutes deze laesies kunnen repareren, zijn de meest grondig bestudeerde DSB-reparatieroutes homologe recombinatie (HR) en niet-homologe eindverbinding (NHEJ). HR is een grotendeels foutloos pad dat een DSB repareert met behulp van een zusterchromatide als homoloog sjabloon. Dit gebeurt meestal in de S-fase en G2-fase van een celcyclus 5,6,7. NHEJ is meer foutgevoelig, maar het kan gebeuren gedurende de hele celcyclus 8,9. Er zijn verschillende reporter assays ontwikkeld om de efficiëntie van specifieke reparatiemechanismen te meten 10,11,12. Deze testen hebben de neiging om te vertrouwen op flowcytometrie voor een hoge doorvoermeting van DSB-reparatiepadactiviteit met behulp van GFP of mCherry als een uitlezing11,13. Hoewel ze zeer efficiënt zijn, vertrouwen ze op canonieke reparatie die plaatsvindt bij een kunstmatig geïntroduceerde DSB.
Er zijn verschillende andere methoden die worden gebruikt om DSB-reparatie te bestuderen. Veel van deze zijn afhankelijk van immunofluorescentie (IF) microscopie 1,14. IF-microscopie detecteert discrete nucleaire foci die representatief zijn voor reparatiecomplexen nadat DSB’s zijn geïnduceerd door blootstelling aan genotoxische chemicaliën of ioniserende straling15,16. Het volgen van de vorming en resolutie van deze foci geeft een indicatie van reparatie-initiatie en voltooiing, respectievelijk14,17. Deze methoden van DSB-inductie (d.w.z. chemicaliën of ioniserende straling) veroorzaken echter geen DSB’s op gedefinieerde locaties in het genoom. Het is ook functioneel onmogelijk om ze te gebruiken om consequent slechts een klein aantal (bijv. 2-4) DSB’s te induceren. Als gevolg hiervan veroorzaken de meest gebruikte methoden voor het induceren van DSB’s een groot aantal laesies die willekeurig over het genoom zijn verdeeld18. Een klein aantal DSB’s kan worden geïntroduceerd door de herkenningsplaats voor een zeldzaam snijdend endonuclease in te voegen en het relevante endonuclease tot expressie te brengen, zoals I-Sce119. Helaas voorkomt de vereiste integratie van een doellocatie het onderzoek van DSB bij endogene genomische loci.
Dit manuscript beschrijft een methode om mutaties te detecteren die verband houden met de reparatie van een DSB gegenereerd op een door de gebruiker gedefinieerde locus. We geven een representatief voorbeeld van de aanpak die wordt toegepast om het vermogen van een viraal eiwit te beoordelen om het aantal mutaties geassocieerd met een DSB te verhogen. Specifiek beschrijft dit manuscript het gebruik van een single guide RNA (sgRNA) om een CAS9-endonuclease te sturen om een DSB te induceren bij menselijk CD4 open leesframe in menselijke voorhuid keratinocyten die vectorcontrole tot expressie brengen (HFK LXSN) en HFK die het E6-eiwit van humaan papillomavirus type 8 (HFK 8E6) tot expressie brengt. Gerichte next-generation sequencing (NGS) van het gebied rond de breuk maakt het mogelijk mutaties geassocieerd met het herstel van de laesie rigoureus te definiëren. Deze gegevens tonen aan dat het virale eiwit een ongeveer 20-voudige toename van mutaties veroorzaakt tijdens DSB-reparatie. Het biedt ook een onbevooroordeelde karakterisering van de mutagene gevolgen van DSB’s op een enkele locatie zonder de noodzaak van sequencing van het hele genoom. In principe zou het protocol gemakkelijk kunnen worden aangepast om het relatieve risico op mutaties tussen genoomloci of cellijnen te vergelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Naast de diepte van de verstrekte informatie, zijn er verschillende voordelen aan deze methode. Ten eerste kan DSB-reparatie in theorie worden beoordeeld op elke genomische loci zonder het genoom van de cel van belang te wijzigen. Ten tweede wordt de toegang tot NGS-analyse van reparatie vergroot door de lagere kosten en rekeninspanning die wordt geboden door het maken en analyseren van een enkele DSB gericht op een bepaald gebied. Ten slotte, nu de genomen van extra organismen routinematig beschikbaar komen en meerdere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gerapporteerd in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW en RP); Nationaal Kankerinstituut van de National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center in Kansas State University; en het Amerikaanse ministerie van Defensie (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). We waarderen KSU-CVM Confocal Core en Joel Sanneman voor onze immunofluorescentiemicroscopie. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van deze financieringsagentschappen.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
