استخدام تسلسل الجيل التالي لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج الناجم عن CAS9 بالقرب من مروج CD4
Summary
يظهر هنا إندونوكلياز sgRNA/CAS9 وبروتوكول تسلسل الجيل التالي الذي يمكن استخدامه لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج بالقرب من مروج CD4.
Abstract
فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) في الحمض النووي هي النوع الأكثر سمية للخلايا من تلف الحمض النووي. نظرا لأن عددا لا يحصى من الإهانات يمكن أن يؤدي إلى هذه الآفات (على سبيل المثال ، إجهاد النسخ المتماثل ، والإشعاع المؤين ، وتلف الأشعة فوق البنفسجية غير المصلحة) ، تحدث DSBs في معظم الخلايا كل يوم. بالإضافة إلى موت الخلايا ، تقلل DSBs التي لم يتم إصلاحها من سلامة الجينوم ويمكن أن تؤدي الطفرات الناتجة إلى تكوين الأورام. هذه المخاطر وانتشار DSBs يحفز التحقيقات في الآليات التي تقوم الخلايا من خلالها بإصلاح هذه الآفات. يمكن إقران تسلسل الجيل التالي بتحريض DSBs عن طريق الإشعاع المؤين لتوفير أداة قوية لتحديد الطفرات المرتبطة بعيوب إصلاح DSB بدقة. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج تحديا حسابيا وتكلفة باهظة لتسلسل الجينوم الكامل للكشف عن إصلاح DSBs التي تحدث بشكل عشوائي المرتبطة بالإشعاع المؤين. توفر الإندونوكليز النادرة القطع ، مثل I-Sce1 ، القدرة على توليد DSB واحد ، ولكن يجب إدخال مواقع التعرف عليها في الجينوم محل الاهتمام. ونتيجة لذلك ، فإن موقع الإصلاح مصطنع بطبيعته. تسمح التطورات الحديثة لتوجيه الحمض النووي الريبي (sgRNA) بتوجيه إندونوكليز Cas9 إلى أي موضع جينوم ذي أهمية. يمكن تطبيق ذلك على دراسة إصلاح DSB مما يجعل تسلسل الجيل التالي أكثر فعالية من حيث التكلفة من خلال السماح له بالتركيز على الحمض النووي المحيط ب DSB الناجم عن Cas9. الهدف من المخطوطة هو إثبات جدوى هذا النهج من خلال تقديم بروتوكول يمكنه تحديد الطفرات التي تنبع من إصلاح DSB في المنبع من جين CD4. يمكن تكييف البروتوكول لتحديد التغيرات في الإمكانات الطافرة ل DSB المرتبطة بالعوامل الخارجية ، مثل مثبطات الإصلاح ، والتعبير عن البروتين الفيروسي ، والطفرات ، والتعرض البيئي مع متطلبات حسابية محدودة نسبيا. بمجرد تسلسل جينوم الكائن الحي ، يمكن استخدام هذه الطريقة نظريا في أي موضع جينومي وفي أي نموذج لزراعة الخلايا لهذا الكائن الحي يمكن نقله. ويمكن أن تسمح التعديلات المماثلة للنهج بإجراء مقارنات بين دقة الإصلاح بين مواقع مختلفة في نفس الخلفية الجينية.
Introduction
الحفاظ على الاستقرار الجينومي أمر بالغ الأهمية لجميع الكائنات الحية. يعد تكرار الحمض النووي الدقيق والاستجابة القوية لتلف الحمض النووي (DDR) ضروريين لنشر المادة الوراثية بأمانة 1,2. تحدث أضرار الحمض النووي بانتظام في معظم الخلايا 2,3. عندما يتم استشعار هذه الأضرار ، يتم إيقاف تقدم دورة الخلية ، ويتم تنشيط آليات إصلاح الحمض النووي. فواصل الخيوط المزدوجة في الحمض النووي أو DSBs هي النوع الأكثر سمية وطفرا من تلف الحمض النووي 3,4.
في حين أن العديد من مسارات إشارات DDR يمكن أن تصلح هذه الآفات ، فإن مسارات إصلاح DSB الأكثر دراسة بدقة هي إعادة التركيب المتماثلة (HR) والانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). الموارد البشرية هي مسار خال من الأخطاء إلى حد كبير يقوم بإصلاح DSB باستخدام كروماتيد شقيق كقالب متماثل. يميل هذا إلى الحدوث في المرحلة S والمرحلة G2 من دورة الخلية 5,6,7. NHEJ أكثر عرضة للخطأ ، ولكن يمكن أن يحدث طوال دورة الخلية 8,9. تم تطوير العديد من اختبارات المراسلين لقياس كفاءة آليات الإصلاح المحددة 10،11،12. تميل هذه الفحوصات إلى الاعتماد على قياس التدفق الخلوي لقياس الإنتاجية العالية لنشاط مسار إصلاح DSB باستخدام GFP أو mCherry كقراءة11,13. على الرغم من كفاءتها العالية ، إلا أنها تعتمد على الإصلاح الأساسي الذي يحدث في DSB الذي تم تقديمه بشكل مصطنع.
هناك مجموعة متنوعة من الطرق الأخرى المستخدمة لدراسة إصلاح DSB. يعتمد العديد من هذه على الفحص المجهري للتألق المناعي (IF) 1,14. إذا اكتشف الفحص المجهري البؤر النووية المنفصلة الممثلة لمجمعات الإصلاح بعد أن يتم تحفيز DSBs عن طريق التعرض للمواد الكيميائية السامة وراثيا أو الإشعاع المؤين15,16. يوفر تتبع تكوين هذه البؤر وحلها مؤشرا على بدء الإصلاح والانتهاء منه ، على التوالي14,17. ومع ذلك ، فإن طرق تحريض DSB هذه (أي المواد الكيميائية أو الإشعاع المؤين) لا تسبب DSBs في مواقع محددة في الجينوم. كما أنه من المستحيل وظيفيا استخدامها لحث عدد صغير فقط (على سبيل المثال ، 2-4) من DSBs. ونتيجة لذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لتحفيز DSBs تسبب العديد من الآفات الموزعة عشوائيا في جميع أنحاء الجينوم18. يمكن إدخال عدد صغير من DSBs عن طريق إدخال موقع التعرف على endonuclease نادر القطع والتعبير عن endonuclease ذات الصلة ، مثل I-Sce119. لسوء الحظ ، فإن التكامل المطلوب للموقع المستهدف يمنع فحص DSB في المواقع الجينومية الذاتية.
تصف هذه المخطوطة طريقة للكشف عن الطفرات المرتبطة بإصلاح DSB الذي تم إنشاؤه في موضع محدد من قبل المستخدم. نحن نقدم مثالا تمثيليا للنهج المطبق لتقييم قدرة البروتين الفيروسي على زيادة عدد الطفرات المرتبطة ب DSB. على وجه التحديد، تصف هذه المخطوطة استخدام الحمض النووي الريبي (sgRNA) لتوجيه إندونوكلياز CAS9 لحث DSB في إطار القراءة المفتوح CD4 البشري في الخلايا الكيراتينية القلفة البشرية التي تعبر عن مكافحة النواقل (HFK LXSN) و HFK التي تعبر عن بروتين E6 لفيروس الورم الحليمي البشري من النوع 8 (HFK 8E6). يسمح تسلسل الجيل التالي المستهدف (NGS) للمنطقة المحيطة بالكسر بتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح الآفة بدقة. تظهر هذه البيانات أن البروتين الفيروسي يسبب زيادة حوالي 20 ضعفا في الطفرات أثناء إصلاح DSB. كما أنه يوفر توصيفا غير متحيز للعواقب الطافرة ل DSBs في موضع واحد دون الحاجة إلى تسلسل الجينوم الكامل. من حيث المبدأ، يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لمقارنة المخاطر النسبية للطفرات بين مواقع الجينوم أو خطوط الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالإضافة إلى عمق المعلومات المقدمة ، هناك العديد من المزايا لهذه الطريقة. أولا ، يمكن تقييم إصلاح DSB ، من الناحية النظرية ، في أي موقع جينومي دون تعديل جينوم الخلية محل الاهتمام. ثانيا ، يتم زيادة الوصول إلى تحليل NGS للإصلاح من خلال انخفاض التكلفة والجهد الحسابي الذي يوفره إنشاء وتحليل DSB وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث الواردة في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P20GM130448) (NAW و RP) ؛ المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NCI R15 CA242057 01A1) ؛ مركز جونسون لأبحاث السرطان في جامعة ولاية كانساس. ووزارة الدفاع الأمريكية (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). نحن نقدر KSU-CVM Confocal Core و Joel Sanneman للفحص المجهري المناعي لدينا. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لوكالات التمويل هذه.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
