Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi
Summary
Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Tek etki alanı antikorları (nanobodies) proteinlerin mekanistik ve yapısal çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır ve çoğu ışınlayıcılar gibi membran proteinlerinin inhibisyonuna bağlı olan klinik tedaviler geliştirmek için araç olarak muazzam bir potansiyel oluşturmaktadır. Bununla birlikte, taşıma etkinliğinin inhibisyonunu belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğunun yüksek verimli rutinlerde gerçekleştirilmesi zordur ve etiketli substratların kullanılabilirliğine bağlıdır, böylece büyük nanobody kütüphanelerinin taranmasını zorlaştırır. Katı destekli membran (SSM) elektrofizyolojisi, elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek ve taşıma kinetiğini ve inhibisyonunu ölçmek için kullanılan yüksek verimli bir yöntemdir. Burada, elektrojenik ikincil taşıyıcıyı hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodileri seçmek ve nanobodies inhibitör sabitlerini hesaplamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin uygulanmasını gösteriyoruz. Bu teknik özellikle etiketli substratların bulunmadığı taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodies seçmek için yararlı olabilir.
Introduction
Antikorlar, antijen bağlanmasından sorumlu iki özdeş ağır zincir ve iki ışık zincirinden oluşur. Kamelyalar sadece konvansiyonel antikorlara kıyasla kognat antijenleri için benzer benzeşim gösteren ağır zincirli antikorlara sahiptir1,2. Sadece ağır zincirli antikorların tek değişken etki alanı (VHH) tam antijen bağlama potansiyelini korur ve çok kararlı olduğu gösterilmiştir1,2. Bu izole VHH molekülleri veya “nanobodies” membran proteinleri biyokimya ile ilgili çalışmalarda konsültasyonları stabilize etmek için araçlar olarakuygulanmıştır 3,4, inhibitörler olarak5,6, stabilizasyon ajanları olarak7, ve yapı belirleme için araçlar olarak8,9,10 . Nanobodies, hedefe özgü nanobodları kodlayan B hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi ve daha sonra B hücrelerinin izolasyonu için kamelyaların bağışıklanması ve ardından nanobody kütüphanesinin klonlanması ve faj ekranı ile seçilmesi ile üretilebilir11,12,13. Nanobodies oluşturmanın alternatif bir yolu, kütüphanelerin inşasına ve faj ekranı, ribozom ekran veya maya ekranı 14 , 15,16, 17,18,19,20ile seçime dayanan in vitro seçimyöntemlerinedayanmaktadır. Bu in vitro yöntemler büyük kütüphane boyutları gerektirir, ancak hayvan bağışıklamadan kaçınmaktan yararlanır ve nispeten düşük stabiliteye sahip proteinleri hedefleyen nanobodies seçimini tercih eder.
Nanobodilerin küçük boyutu, yüksek stabilite ve çözünürlükleri, güçlü antijen benzeşimi, düşük immünojeniklik ve nispeten kolay üretim, onları terapötiklerin gelişimi için güçlü adaylar haline getirir21,22,23. Özellikle, çoklu membran proteinlerinin aktivitesini engelleyen nanobodies klinik uygulamalar için potansiyel varlıklardır5,24,25,26. Membran taşıyıcıları söz konusu olduğunda, bir nano gövdenin inhibitör aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmek için, taşınan substratların ve / veya ko-substratların tespit edilmesine izin veren bir test geliştirmek gerekir. Bu tür tahliller genellikle etiketli molekülleri veya evrensel bir uygulamadan yoksun olabilecek substrata özgü algılama yöntemlerinin tasarımını içerir. Ayrıca, inhibitör nanobodies tanımlanması genellikle bağlayıcıların çok sayıda taranır gerektirir. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı modunda kullanılabilen ve etiketli alt tabakalara dayanmayan bir yöntem bu seçim için gereklidir.
SSM tabanlı elektrofizyoloji, membranlar (örneğin, iyon bağlama/taşıma)27,28boyunca yüklerin hareketinin algılanmasını sağlayan son derece hassas, son derece zaman çözülen bir tekniktir. Bu teknik, bu proteinlerin 29 , 30 , 31 ,32, 33 ,34,35‘in göreceli düşük cirosu nedeniyle diğer elektrofizyoloji tekniklerini kullanarak çalışması zor olan elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek için uygulanmıştır. SSM elektrofizyolojisi etiketli substratların kullanılmasını gerektirmez, yüksek verimli tarama için uygundur ve ilgi çekici taşıyıcıyı içeren proteolipozomlar veya membran vezikülleri kullanılabilir. Burada, SSM tabanlı elektrofizyolojinin ışınlayıcı hedefli nanobodies’i inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerle sınıflandırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz. İlke kanıtı olarak, bakteriyel kolin taşıyıcısının lipozomlara yeniden yapılandırılmasını ve ardından SSM sensörlerindeki proteolipozomların hareketsiz hale getirilmesi için ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Daha sonra kolin taşımacılığının SSM tabanlı elektrofizyoloji ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini ve yarı maksimal etkili konsantrasyonun nasıl belirlendiğini açıklıyoruz (EC50). Daha sonra birden fazla nanobodiyleri taramak ve kolin taşıma inhibitörlerini tanımlamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, seçilen inhibitör nanobodilerin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarının(IC 50)nasıl belirlendiğini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan teknik, elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklere sahip nanobodları sınıflandırır. Substrat taşımacılığının değerlendirilmesi, proteolipozomların zarlarına gömülü taşıyıcı aracılığıyla yüklerin hareketinin tespit edilmesi nedeniyle mümkündür. Bir deneyin kurulumu sırasındaki kritik adımlardan bazıları, lipozomlardaki aktif proteinin yeniden uzlaştırılması, SSM yongalarında kararlı monolayerlerin hazırlanması ve bağlı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zürih Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü’nden Cedric A. J. Hutter ve Markus A. Seeger’a ve Basel Üniversitesi Biozentrum’dan Gonzalo Cebrero’ya sentetik nanobodies (siyadlar) üretimindeki işbirliği için teşekkür ederiz. Nanion Technologies’den Maria Barthmes ve Andre Bazzone’a teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) (PP00P3_170607 ve NANION Research Grant Initiative tarafından C.P.’ye desteklendi.
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
