Выбор ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортер, с помощью электрофизиологии на основе твердой мембраны (SSM)
Summary
Нанотела являются важными инструментами в структурной биологии и представляют большой потенциал для развития методов лечения. Однако выбор нанотел с ингибирующими свойствами может быть сложным. Здесь мы демонстрируем использование электрофизиологии на основе твердой поддерживаемой мембраны (SSM) для классификации ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенные мембранные транспортеры.
Abstract
Однодоменные антитела (нанотела) широко используются в механистических и структурных исследованиях белков, и они представляют собой огромный потенциал в качестве инструментов для разработки клинических методов лечения, многие из которых зависят от ингибирования мембранных белков, таких как транспортеры. Однако большинство методов, используемых для определения ингибирования транспортной активности, трудно выполнить в процедурах с высокой пропускной способностью и зависят от наличия меченых подложек, что усложняет скрининг больших библиотек нанотел. Электрофизиология твердой мембраны (SSM) является высокопроизводительным методом, используемым для характеристики электрогенных транспортеров и измерения их кинетики транспорта и ингибирования. Здесь мы показываем реализацию электрофизиологии на основе SSM для выбора ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенный вторичный транспортер, и для расчета ингибирующих констант нанотел. Этот метод может быть особенно полезен для выбора ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортеры, для которых меченые субстраты недоступны.
Introduction
Антитела состоят из двух одинаковых тяжелых цепей и двух легких цепей, которые отвечают за связывание антигена. Верблюды имеют только тяжелоцепочечные антитела, которые проявляют аналогичное сродство к их родственному антигену по сравнению с обычными антителами1,2. Однопеременный домен (VHH) антител только с тяжелой цепью сохраняет полный антигенсвязывающий потенциал и, как было показано, очень стабилен1,2. Эти изолированные молекулы VHH или «нанотела» были реализованы в исследованиях, связанных с биохимией мембранных белков, в качестве инструментов для стабилизации конформаций3,4,в качестве ингибиторов5,6,в качестве стабилизирующих агентов7и в качестве устройств для определения структуры8,9,10 . Нанотела могут быть получены путем иммунизации верблюдов для предварительного обогащения В-клеток, кодирующих целевые нанотела, и последующей изоляции В-клеток с последующим клонированием библиотеки нанотел и отбором фагового дисплея11,12,13. Альтернативный способ генерации нанотел основан на методах отбора in vitro, которые основаны на построении библиотек и выборе с помощью фагового дисплея, рибосомного дисплея или дрожжевого дисплея14,15,16,17,18,19,20. Эти методы in vitro требуют больших размеров библиотек, но выигрывают от избегания иммунизации животных и способствуют отбору нанотел, нацеленных на белки с относительно низкой стабильностью.
Небольшие размеры нанотел, их высокая стабильность и растворимость, сильное сродство антигенов, низкая иммуногенность и относительно легкая продукция, делают их сильными кандидатами для разработкитерапии 21,22,23. В частности, нанотела, ингибирующие активность множественных мембранных белков, являются потенциальными активами для клинических применений5,24,25,26. В случае мембранных транспортеров, чтобы оценить, обладает ли нанотело ингибирующей активностью, необходимо разработать анализ, который позволяет обнаруживать транспортируемые субстраты и/или сопутствующие субстраты. Такие анализы обычно включают меченые молекулы или разработку методов обнаружения, специфичных для субстрата, которые могут не иметь универсального применения. Кроме того, идентификация ингибирующих нанотел обычно требует скрининга большого количества связующих веществ. Таким образом, метод, который может быть использован в режиме высокой пропускной способности и который не полагается на меченые подложки, имеет важное значение для этого выбора.
Электрофизиология на основе SSM является чрезвычайно чувствительным методом с высоким временным разрешением, который позволяет обнаруживать движение зарядов по мембранам (например, связывание/перенос ионов)27,28. Данная методика была применена для характеристики электрогенных транспортеров, которые трудно изучить с помощью других методов электрофизиологии из-за относительно низкого оборота этих белков29,30,31,32,33,34,35. Электрофизиология SSM не требует использования меченых подложек, она подходит для высокопроизводительного скрининга, и могут использоваться либо протеолипосомы, либо мембранные везикулы, содержащие интересующий транспортер. Здесь мы демонстрируем, что электрофизиология на основе SSM может быть использована для классификации нанотел, нацеленных на транспортер, с ингибирующими и неингибирующими свойствами. В качестве доказательства принципа мы описываем восстановление бактериального холинового транспортера в липосомы с последующими подробными шагами по иммобилизации протеолипосом на датчиках SSM. Далее мы опишем, как выполнить электрофизиологические измерения переноса холина на основе SSM и как определить полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50). Затем мы покажем, как использовать электрофизиологию на основе SSM для скрининга нескольких нанотел и идентификации ингибиторов транспорта холина. Наконец, мы описываем, как определить половину максимальных ингибирующих концентраций (IC50)выбранных ингибирующих нанотел.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, представленный здесь, классифицирует нанотела с ингибирующими и неингибирующими свойствами, нацеленными на электрогенные транспортеры. Оценка переноса субстрата возможна за счет обнаружения движения зарядов через транспортер, встроенный в мембрану протеолипосом. Некоторые и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Седрика А. Хуттера и Маркуса А. Сигера из Института медицинской микробиологии Цюрихского университета и Гонсало Чебреро из Biozentrum Базельского университета за сотрудничество в создании синтетических нанотел (сител). Мы благодарим Марию Бартмс и Андре Баззоне из NANION Technologies за техническую помощь. Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (SNSF) (PP00P3_170607 и NANION Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
