固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

抗体は、2つの同一の重鎖と、抗原結合を担う2つの軽鎖から構成される。ラクダは、従来の抗体^1,2と比較して、同結合抗原に対して類似した親和性を示す重鎖のみの抗体を有する。重鎖のみの抗体の単一可変ドメイン(VHH)は、完全な抗原結合電位を保持し、非常^{に安定であることが1、2}であることが示されている。これらの単離されたVHH分子または「ナノボディ」は、立体構造を安定化するためのツールとして膜タンパク質生化学に関連する研究に実施されている^3,4, 阻害剤として^5,6, 安定化剤として⁷, 構造決定のためのガジェットとして^8,9,10.ナノボディは、B細胞の標的特異的ナノボディおよびその後の単離をコードするB細胞の前濃縮のためのカメリッドの免疫化によって生成することができ、続いてnanobodyライブラリのクローニングとファージディスプレイ^11、12、13による選択を行^う。ナノボディを生成する別の方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母ディスプレイ^{14、15、16、17、18、19、20}によるライブラリおよび選択の構築に依存するインビトロ選択方法に基づく。これらのin vitro法は、大きなライブラリサイズを必要としますが、動物の免疫を回避することから利益を得て、比較的低い安定性を有するタンパク質を標的とするナノボディの選択を好む。

ナノボディの小型化は、その高い安定性および溶解性、強い抗原親和性、低い免疫原性、および比較的容易な産生を、治療^21、22、23の開発のための有力な候補となる。特に、複数の膜タンパク質の活性を阻害するナノボディは、臨床応用^{5、24、25、26}の潜在的な資産である。膜輸送体の場合、ナネnobodyが阻害活性を有するかどうかを評価するためには、輸送された基質および/または共基質の検出を可能にするアッセイを開発する必要がある。このようなアッセイは、通常、標識された分子または基質特異的検出方法の設計を伴い、普遍的な適用を欠く可能性がある。さらに、阻害性ナノボディの同定には、一般に多数の結合剤のスクリーニングが必要である。したがって、ハイスループットモードで使用でき、ラベル付き基板に依存しない方法がこの選択に不可欠です。

SSMベースの電気生理学は、膜を越えて電荷の移動(例えば、イオン結合/輸送^)27、28を検出することを可能にする非常に敏感で、非常に時間分解された技術である。この技術は、これらのタンパク質の相対的低回転率に起因する他の電気生理学的手法を用いて研究することが困難である電気原性トランスポーターの特徴付けに適用されてきた29、30、31、32、33、34、35。SSM電気生理学は標識された基質の使用を必要とせず、ハイスループットスクリーニングに適しており、また、目的のトランスポーターを含むプロテオリポソームまたは膜小胞のいずれかを使用することができる。ここでは、SSMベースの電気生理学が、トランスポーター標的ナノボディを阻害性および非阻害特性で分類できることを実証する。原理の証明として、我々はリポソームに細菌コリントランスポーターの再構成を記述し、続いてSSMセンサー上のプロテオリポソームの固定化のための詳細なステップを述べています。次に、コリン輸送のSSMベースの電気生理学的測定を行う方法と、半最大有効濃度を決定する方法について説明します(EC_50)。次に、SSMベースの電気生理学を用いて、複数のナノボディをスクリーニングし、コリン輸送の阻害剤を同定する方法を示す。最後に、選択した阻害性ナノボディの半最大阻害濃度_(IC50)を決定する方法を説明する。