Selezione di nanocorpi inibitori mirati al trasportatore mediante elettrofisiologia basata su membrana supportata da solidi (SSM)
Summary
I nanocorpi sono strumenti importanti in biologia strutturale e rappresentano un grande potenziale per lo sviluppo di terapie. Tuttavia, la selezione di nanocorpi con proprietà inibitorie può essere impegnativa. Qui dimostriamo l’uso dell’elettrofisiologia basata sulla membrana supportata da solidi (SSM) per la classificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira i trasportatori di membrana elettrogenici.
Abstract
Gli anticorpi a dominio singolo (nanocorpi) sono stati ampiamente utilizzati negli studi meccanicistici e strutturali delle proteine e rappresentano un enorme potenziale come strumenti per lo sviluppo di terapie cliniche, molte delle quali dipendono dall’inibizione delle proteine di membrana come i trasportatori. Tuttavia, la maggior parte dei metodi utilizzati per determinare l’inibizione dell’attività di trasporto sono difficili da eseguire in routine ad alto rendimento e dipendono dalla disponibilità di substrati etichettati, complicando così lo screening di grandi librerie di nanocorpi. L’elettrofisiologia a membrana a supporto solido (SSM) è un metodo ad alto rendimento, utilizzato per caratterizzare i trasportatori elettrogenici e misurarne la cinetica di trasporto e l’inibizione. Qui mostriamo l’implementazione dell’elettrofisiologia basata sull’SSM per selezionare nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira un trasportatore secondario elettrogenico e per calcolare costanti inibitorie dei nanocorpi. Questa tecnica può essere particolarmente utile per selezionare nanocorpi inibitori mirati ai trasportatori per i quali non sono disponibili substrati marcati.
Introduction
Gli anticorpi sono composti da due catene pesanti identiche e due catene leggere che sono responsabili del legame con l’antigene. I camelidi hanno solo anticorpi a catena pesante che mostrano affinità simili per il loro antigene affine rispetto agli anticorpi convenzionali1,2. Il dominio variabile singolo (VHH) degli anticorpi a catena pesante mantiene il pieno potenziale di legame con l’antigene e ha dimostrato di essere molto stabile1,2. Queste molecole VHH isolate o “nanocorpi” sono state implementate in studi relativi alla biochimica delle proteine di membrana come strumenti per stabilizzare le conformazioni3,4,come inibitori5,6,come agenti di stabilizzazione7e come gadget per la determinazione della struttura8,9,10 . I nanocorpi possono essere generati dall’immunizzazione dei camelidi per il pre-arricchimento delle cellule B che codificano nanocorpi bersaglio-specifici e il successivo isolamento delle cellule B, seguito dalla clonazione della libreria nanocorporea e dalla selezione mediante visualizzazione fagica11,12,13. Un modo alternativo per generare nanocorpi si basa su metodi di selezione in vitro che si basano sulla costruzione di librerie e selezione tramite visualizzazione di fagi, display ribosomi o display di lievito14,15,16,17,18,19,20. Questi metodi in vitro richiedono grandi dimensioni della libreria, ma traggono vantaggio dall’evitare l’immunizzazione animale e favoriscono la selezione di nanocorpi che prendono di mira proteine con stabilità relativamente bassa.
Le piccole dimensioni dei nanocorpi, la loro elevata stabilità e solubilità, la forte affinità antigenica, la bassa immunogenicità e la produzione relativamente facile, li rendono forti candidati per lo sviluppo di terapie21,22,23. In particolare, i nanocorpi che inibiscono l’attività di più proteine di membrana sono potenziali asset per applicazioni cliniche5,24,25,26. Nel caso di trasportatori a membrana, per valutare se un nanocorpo ha attività inibitoria, è necessario sviluppare un saggio che consenta la rilevazione di substrati e/o co-substrati trasportati. Tali saggi di solito coinvolgono molecole etichettate o la progettazione di metodi di rilevamento specifici del substrato, che possono mancare di un’applicazione universale. Inoltre, l’identificazione di nanocorpi inibitori richiede generalmente lo screening di un gran numero di leganti. Pertanto, un metodo che può essere utilizzato in una modalità ad alto rendimento e che non si basa su substrati etichettati è essenziale per questa selezione.
L’elettrofisiologia basata su SSM è una tecnica estremamente sensibile e altamente risolta nel tempo che consente il rilevamento del movimento delle cariche attraverso le membrane (ad esempio, legame / trasporto ionico)27,28. Questa tecnica è stata applicata per caratterizzare i trasportatori elettrogenici, che sono difficili da studiare utilizzando altre tecniche di elettrofisiologia a causa del relativo basso turnover di queste proteine29,30,31,32,33,34,35. L’elettrofisiologia SSM non richiede l’uso di substrati etichettati, è adatta per lo screening ad alta produttività e possono essere utilizzati proteoliposomi o vescicole di membrana contenenti il trasportatore di interesse. Qui, dimostriamo che l’elettrofisiologia basata su SSM può essere utilizzata per classificare nanocorpi mirati al trasportatore con proprietà inibitorie e non inibitorie. Come prova di principio, descriviamo la ricostituzione di un trasportatore di colina batterica in liposomi, seguita da passaggi dettagliati per l’immobilizzazione dei proteolipolismi sui sensori SSM. Descriviamo poi come eseguire misurazioni elettrofisiologiche basate su SSM del trasporto della colina e come determinare la concentrazione effettiva semi-massimale (EC50). Mostriamo quindi come utilizzare l’elettrofisiologia basata su SSM per lo screening di più nanocorpi e per identificare gli inibitori del trasporto della colina. Infine, descriviamo come determinare le concentrazioni inibitorie semimastre massime (IC50) di nanocorpi inibitori selezionati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica qui presentata classifica i nanocorpi con proprietà inibitorie e non inibitorie mirate ai trasportatori elettrogenici. La valutazione del trasporto del substrato è possibile grazie al rilevamento del movimento delle cariche attraverso il trasportatore incorporato nella membrana dei proteoliposomi. Alcuni dei passaggi critici durante la configurazione di un esperimento sono la ricostituzione di proteine attive nei liposomi, la preparazione di monostrati stabili su chip SSM e il recupero delle condizioni inizi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Cedric A. J. Hutter e Markus A. Seeger dell’Istituto di microbiologia medica dell’Università di Zurigo e Gonzalo Cebrero del Biozentrum dell’Università di Basilea per la collaborazione nella generazione di nanocorpi sintetici (sicorpi). Ringraziamo Maria Barthmes e Andre Bazzone di NANION Technologies per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (FNS) (PP00P3_170607 e nanion Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
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