מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)
Summary
ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.
Abstract
נוגדנים חד-תחומיים (ננו-בודים) שימשו בהרחבה במחקרים מכניים ומבניים של חלבונים והם מהווים פוטנציאל עצום ככלים לפיתוח טיפולים קליניים, שרבים מהם תלויים בעיכוב חלבונים ממברנים כגון מובילים. עם זאת, רוב השיטות המשמשות לקביעת עיכוב פעילות התחבורה קשה לבצע בשגרות תפוקה גבוהה ותלויים בזמינות מצעים מסומנים ובכך לסבך את ההקרנה של ספריות ננו-גוף גדולות. אלקטרופיזיולוגיה של ממברנה מוצקה (SSM) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה, המשמשת לאפיון מובילים אלקטרוגניים ולמדידת קינטיקה ועיכוב ההובלה שלהם. כאן אנו מראים את היישום של אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לבחור ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגר משני אלקטרוגני ולחשב קבועים מעכבי ננו-בונים. טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לבחירת ננו-בומניות מעכבות המתמקדות במשגרים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים.
Introduction
הנוגדנים מורכבים משתי שרשראות כבדות זהות ושתי שרשראות אור האחראיות על כריכת האנטיגן. לקמלים יש נוגדנים בעלי שרשרת כבדה בלבד שמפגינים זיקה דומה לאנטיגן הקוגנייט שלהם בהשוואה לנוגדנים קונבנציונליים1,2. התחום המשתנה היחיד (VHH) של נוגדנים כבדי שרשרת בלבד שומר על הפוטנציאל המלא של איגוד האנטיגן והוכח כיציב מאוד1,2. מולקולות VHH מבודדות אלה או “ננו-בודים” יושמו במחקרים הקשורים לביוכימיה של חלבוני ממברנה ככלים לייצוב קונפורמציות3,4, כמעכבים5,6, כסוכני ייצוב7, וכקאדג’טים לקביעת מבנה8,9,10 . Nanobodies יכול להיווצר על ידי חיסון של camelids עבור טרום העשרה של תאי B המקודדים ננו-בודים ספציפיים למטרה ובידוד לאחר מכן של תאי B, ואחריו שיבוט של ספריית nanobody ובחירה על ידי תצוגת פאג’11,12,13. דרך חלופית ליצירת ננו-ביגודים מבוססת על שיטות בחירה במבחנה הנשענות על בניית ספריות ובחירה על ידי תצוגת פאג ‘, תצוגת ריבוזום או תצוגת שמרים14,15,16,17,18,19,20. שיטות הפריה חוץ גופית אלה דורשות גדלי ספרייה גדולים אך נהנות מהימנעות מחיסון בעלי חיים ומעדיפים את בחירת הננו-ביגודים המתמקדים בחלבונים ביציבות נמוכה יחסית.
הגודל הקטן של nanobodies, היציבות הגבוהה שלהם מסיסות, זיקה אנטיגן חזקה, אימונוגניות נמוכה, וייצור קל יחסית, להפוך אותם מועמדים חזקים לפיתוח של טיפולי21,22,23. בפרט, nanobodies המעכב את הפעילות של חלבונים ממברנה מרובים הם נכסים פוטנציאליים עבור יישומים קליניים5,24,25,26. במקרה של מובילי ממברנה, כדי להעריך אם לננו-גוף יש פעילות מעכבת, יש צורך לפתח בבדיקה המאפשרת זיהוי של מצעים מועברים ו/או מצעים משותפים. בדיקות כאלה כרוכות בדרך כלל במולקולות מסומנות או בעיצוב שיטות זיהוי ספציפיות למצע, אשר עשויות להיות חסרות יישום אוניברסלי. יתר על כן, זיהוי של nanobodies מעכב בדרך כלל דורש הקרנה של מספר גדול של קלסרים. לכן, שיטה שניתן להשתמש בה במצב תפוקה גבוהה ואינה מסתמכת על מצעים מסומנים חיונית לבחירה זו.
אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM היא טכניקה רגישה ביותר, פתורה מאוד זמן המאפשר זיהוי של תנועה של מטענים על פני ממברנות (למשל, יונים מחייב / הובלה)27,28. טכניקה זו יושמה כדי לאפיין מובילים אלקטרוגניים, אשר קשה ללמוד באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות אחרות בשל המחזור הנמוך יחסית של חלבונים אלה29,30,31,32,33,34,35. אלקטרופיזיולוגיה SSM אינה דורשת שימוש במצעים מסומנים, היא מתאימה להקרנה בתפוקה גבוהה, וניתן להשתמש בפרוטואוליפוזומים או בשלל ממברנה המכיל את המשגר של עניין. כאן, אנו מדגימים כי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM יכולה לשמש כדי לסווג ננו-בודיות ממוקדות טרנספורטר עם תכונות מעכבות ולא מעכבות. כהוכחה לעקרון, אנו מתארים את השיקום של טרנספורטר כולין חיידקי לליפוזומים, ואחריו צעדים מפורטים לשתקת פרוטאוליפוזומים בחיישני SSM. לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות SSM של הובלת כולין וכיצד לקבוע את הריכוז האפקטיבי למחצה (EC50). לאחר מכן אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסנן ננו-בודיות מרובות ולזהות מעכבים של הובלת כולין. לבסוף, אנו מתארים כיצד לקבוע את ריכוזי המעכבים המקסימליים למחצה (IC50) של ננו-בודיות מעכבות נבחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה המוצגת כאן מסווגת ננו-ביגודיות עם תכונות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים. הערכת הובלת המצע אפשרית בשל זיהוי תנועת המטענים באמצעות המשגר המוטמע בקרום הפרוטאוליפוזומים. חלק מהצעדים הקריטיים במהלך ההתקנה של ניסוי הם שחזור של חלבון פעיל בליפוזומים, הכנת monolayers יציב על…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סדריק א.ג. הוטר ומרקוס א. סיגר מהמכון למיקרוביולוגיה רפואית באוניברסיטת ציריך, ולגונזלו קברו מ-Biozentrum מאוניברסיטת באזל על שיתוף פעולה בדור הננו-בודיות הסינתטיות (sybodies). אנו מודים למריה ברתמס ואנדרה בזון מ-NANION Technologies על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNSF) (יוזמת מענק המחקר PP00P3_170607 ו-NANION ל- C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
