Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie
Summary
Nanobodies sind wichtige Werkzeuge in der Strukturbiologie und stellen ein großes Potenzial für die Entwicklung von Therapien dar. Die Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir den Einsatz von Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierter Elektrophysiologie zur Klassifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies, die auf elektrogene Membrantransporter abzielen.
Abstract
Single-Domain-Antikörper (Nanobodies) wurden in großem Umfang in mechanistischen und strukturellen Studien von Proteinen eingesetzt und stellen ein enormes Potenzial als Werkzeuge für die Entwicklung klinischer Therapien dar, von denen viele von der Hemmung von Membranproteinen wie Transportern abhängen. Die meisten Methoden zur Bestimmung der Hemmung der Transportaktivität sind jedoch in Hochdurchsatzroutinen schwer durchzuführen und hängen von der Verfügbarkeit markierter Substrate ab, wodurch das Screening großer Nanobody-Bibliotheken erschwert wird. Die SSM-Elektrophysiologie (Solid-Supported Membrane) ist eine Hochdurchsatzmethode, die zur Charakterisierung elektrogener Transporter und zur Messung ihrer Transportkinetik und -hemmung verwendet wird. Hier zeigen wir die Implementierung der SSM-basierten Elektrophysiologie zur Auswahl hemmender und nicht-inhibitorischer Nanokörper, die auf einen elektrogenen Sekundärtransporter abzielen, und zur Berechnung von Nanobodies-Hemmkonstanten. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um inhibitorische Nanobodies auszuwählen, die auf Transporter abzielen, für die keine markierten Substrate verfügbar sind.
Introduction
Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei leichten Ketten, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Kameliden haben nur schwerkettige Antikörper, die im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern eine ähnliche Affinität für ihr verwandtes Antigen aufweisen1,2. Die Single Variable Domain (VHH) von nur schwerkettigen Antikörpern behält das volle Antigenbindungspotenzial bei und hat sich als sehr stabilerwiesen 1,2. Diese isolierten VHH-Moleküle oder “Nanobodies” wurden in Studien im Zusammenhang mit der Biochemie von Membranproteinen als Werkzeuge zur Stabilisierung der Konformationen3,4, als Inhibitoren5,6, als Stabilisierungsmittel7und als Gadgets zur Strukturbestimmung8,9,10 . Nanobodies können durch die Immunisierung von Kameliden zur Voranreicherung von B-Zellen, die zielspezifische Nanobodies kodieren, und anschließende Isolierung von B-Zellen erzeugt werden, gefolgt von Klonierung der Nanobody-Bibliothek und Selektion durch Phagenanzeige11,12,13. Eine alternative Möglichkeit, Nanobodies zu erzeugen, basiert auf In-vitro-Selektionsmethoden, die auf dem Aufbau von Bibliotheken und der Selektion durch Phagenanzeige, Ribosomenanzeige oder Hefeanzeigeberuhen 14,15,16,17,18,19,20. Diese In-vitro-Methoden erfordern große Bibliotheksgrößen, profitieren jedoch von der Vermeidung von Tierimmunisierungen und bevorzugen die Auswahl von Nanobodies, die auf Proteine mit relativ geringer Stabilität abzielen.
Die geringe Größe von Nanobodies, ihre hohe Stabilität und Löslichkeit, starke Antigenaffinität, geringe Immunogenität und relativ einfache Herstellung machen sie zu starken Kandidaten für die Entwicklung vonTherapeutika 21,22,23. Insbesondere Nanobodies, die die Aktivität mehrerer Membranproteine hemmen, sind potenzielle Vorteile für klinische Anwendungen5,24,25,26. Im Falle von Membrantransportern ist es notwendig, um zu beurteilen, ob ein Nanobody eine hemmende Aktivität aufweist, einen Assay zu entwickeln, der den Nachweis von transportierten Substraten und/oder Co-Substraten ermöglicht. Solche Assays beinhalten in der Regel markierte Moleküle oder das Design substratspezifischer Nachweismethoden, denen möglicherweise eine universelle Anwendung fehlt. Darüber hinaus erfordert die Identifizierung von inhibitorischen Nanobodies in der Regel das Screening einer großen Anzahl von Bindemitteln. Daher ist ein Verfahren, das in einem Hochdurchsatzmodus eingesetzt werden kann und nicht auf markierte Substrate angewiesen ist, für diese Auswahl unerlässlich.
SSM-basierte Elektrophysiologie ist eine extrem empfindliche, hochgradig zeitaufgelöste Technik, die die Detektion der Bewegung von Ladungen über Membranen (z.B. Ionenbindung/-transport) ermöglicht27,28. Diese Technik wurde angewendet, um elektrogene Transporter zu charakterisieren, die aufgrund des relativ geringen Umsatzes dieser Proteine29, 30 , 31,32,33,34,35mit anderen elektrophysiologischen Techniken schwer zu untersuchen sind. Die SSM-Elektrophysiologie erfordert keine Verwendung von markierten Substraten, sie eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening und es können entweder Proteoliposomen oder Membranvesikel verwendet werden, die den transporter von Interesse enthalten. Hier zeigen wir, dass SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet werden kann, um Transporter-gerichtete Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften zu klassifizieren. Als Proof-of-Principle beschreiben wir die Rekonstitution eines bakteriellen Cholintransporters in Liposomen, gefolgt von detaillierten Schritten zur Immobilisierung von Proteoliposomen auf den SSM-Sensoren. Als nächstes beschreiben wir, wie SSM-basierte elektrophysiologische Messungen des Cholintransports durchzuführen sind und wie die halbmaximale effektive Konzentration (EC50)bestimmt wird. Wir zeigen dann, wie man SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet, um mehrere Nanobodies zu screenen und Inhibitoren des Cholintransports zu identifizieren. Schließlich beschreiben wir, wie die halbmaxim maximalen Hemmkonzentrationen (IC50)ausgewählter inhibitorischer Nanokörper bestimmt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Technik klassifiziert Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften, die auf elektrogene Transporter abzielen. Die Beurteilung des Substrattransports ist aufgrund der Detektion der Ladungsbewegung durch den in die Membran von Proteoliposomen eingebetteten Transporter möglich. Einige der kritischen Schritte während des Aufbaus eines Experiments sind die Rekonstitution von aktivem Protein in Liposomen, die Herstellung stabiler Monoschichten auf SSM-Chips und die Wiederherste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Cedric A. J. Hutter und Markus A. Seeger vom Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich sowie Gonzalo Cebrero vom Biozentrum der Universität Basel für die Zusammenarbeit bei der Erzeugung synthetischer Nanobodies (Sybodies). Wir danken Maria Barthmes und Andre Bazzone von NANION Technologies für die technische Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) (PP00P3_170607 und NANION Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
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