Sélection de nanocorps inhibiteurs ciblant les transporteurs par électrophysiologie à membrane solide (SSM)
Summary
Les nanocorps sont des outils importants en biologie structurale et présentent un grand potentiel pour le développement de thérapies. Cependant, la sélection de nanocorps ayant des propriétés inhibitrices peut être difficile. Nous démontrons ici l’utilisation de l’électrophysiologie à membrane solide (SSM) pour la classification des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs membranaires électrogéniques.
Abstract
Les anticorps à domaine unique (nanocorps) ont été largement utilisés dans les études mécanistes et structurelles des protéines et ils présentent un énorme potentiel en tant qu’outils pour le développement de thérapies cliniques, dont beaucoup dépendent de l’inhibition des protéines membranaires telles que les transporteurs. Cependant, la plupart des méthodes utilisées pour déterminer l’inhibition de l’activité de transport sont difficiles à effectuer dans les routines à haut débit et dépendent de la disponibilité des substrats marqués, ce qui complique le criblage de grandes bibliothèques de nanocorps. L’électrophysiologie à membrane solide (SSM) est une méthode à haut débit, utilisée pour caractériser les transporteurs électrogéniques et mesurer leur cinétique de transport et leur inhibition. Nous montrons ici la mise en œuvre de l’électrophysiologie basée sur le MSU pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant un transporteur secondaire électrogénique et pour calculer les constantes inhibitrices des nanocorps. Cette technique peut être particulièrement utile pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs ciblant des transporteurs pour lesquels des substrats marqués ne sont pas disponibles.
Introduction
Les anticorps sont composés de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères responsables de la liaison à l’antigène. Les camélidés ont des anticorps à chaîne lourde seulement qui présentent une affinité similaire pour leur antigène apparenté par rapport aux anticorps conventionnels1,2. Le domaine variable unique (VHH) des anticorps à chaîne lourde conserve le plein potentiel de liaison à l’antigène et s’est avéré très stable1,2. Ces molécules VHH isolées ou « nanocorps » ont été mises en œuvre dans des études liées à la biochimie des protéines membranaires comme outils de stabilisation des conformations3,4,comme inhibiteurs5,6,comme agents de stabilisation7,et comme gadgets pour la détermination de la structure8,9,10 . Les nanocorps peuvent être générés par l’immunisation des camélidés pour le pré-enrichissement des cellules B qui codent des nanocorps spécifiques à la cible et l’isolement ultérieur des cellules B, suivi du clonage de la bibliothèque de nanocorps et de la sélection par affichage dephages 11,12,13. Une autre façon de générer des nanocorps est basée sur des méthodes de sélection in vitro qui reposent sur la construction de bibliothèques et la sélection par affichage de phages, affichage de ribosomes ou affichage de levure14,15,16,17,18,19,20. Ces méthodes in vitro nécessitent de grandes bibliothèques mais bénéficient d’éviter l’immunisation animale et favorisent la sélection de nanocorps ciblant des protéines relativement peu stables.
La petite taille des nanocorps, leur grande stabilité et solubilité, leur forte affinité antigénique, leur faible immunogénicité et leur production relativement facile en font de bons candidats pour le développement de thérapies21,22,23. En particulier, les nanocorps inhibant l’activité de protéines membranaires multiples sont des atouts potentiels pour des applications cliniques5,24,25,26. Dans le cas des transporteurs membranaires, pour évaluer si un nanocorps a une activité inhibitrice, il est nécessaire de développer un test permettant la détection de substrats transportés et/ou de co-substrats. De tels tests impliquent généralement des molécules marquées ou la conception de méthodes de détection spécifiques au substrat, qui peuvent ne pas avoir d’application universelle. De plus, l’identification de nanocorps inhibiteurs nécessite généralement le criblage d’un grand nombre de liants. Ainsi, une méthode qui peut être utilisée en mode haut débit et qui ne repose pas sur des substrats étiquetés est essentielle pour cette sélection.
L’électrophysiologie basée sur le MSU est une technique extrêmement sensible et très résolue dans le temps qui permet de détecter le mouvement des charges à travers les membranes (par exemple, la liaison /transport d’ions)27,28. Cette technique a été appliquée pour caractériser les transporteurs électrogéniques, qui sont difficiles à étudier en utilisant d’autres techniques d’électrophysiologie en raison du renouvellement relativement faible de ces protéines29,30,31,32,33,34,35. L’électrophysiologie SSM ne nécessite pas l’utilisation de substrats marqués, elle convient au criblage à haut débit et des protéoliposomes ou des vésicules membranaires contenant le transporteur d’intérêt peuvent être utilisés. Ici, nous démontrons que l’électrophysiologie basée sur le MSU peut être utilisée pour classer les nanocorps ciblés par les transporteurs avec des propriétés inhibitrices et non inhibitrices. Comme preuve de principe, nous décrivons la reconstitution d’un transporteur de choline bactérienne en liposomes, suivie d’étapes détaillées pour l’immobilisation des protéoliposomes sur les capteurs SSM. Nous décrivons ensuite comment effectuer des mesures électrophysiologiques basées sur le MSU du transport de la choline et comment déterminer la concentration efficace demi-maximale (EC50). Nous montrons ensuite comment utiliser l’électrophysiologie basée sur le MSU pour dépister plusieurs nanocorps et identifier les inhibiteurs du transport de la choline. Enfin, nous décrivons comment déterminer les concentrations inhibitrices demi-maximales (IC50)de nanocorps inhibiteurs sélectionnés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique présentée ici classe les nanocorps aux propriétés inhibitrices et non inhibitrices ciblant les transporteurs électrogéniques. L’évaluation du transport du substrat est possible grâce à la détection du mouvement des charges à travers le transporteur intégré dans la membrane des protéoliposomes. Certaines des étapes critiques lors de la mise en place d’une expérience sont la reconstitution de protéines actives dans les liposomes, la préparation de monocouches stables sur des puces SSM et …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Cedric A. J. Hutter et Markus A. Seeger de l’Institut de microbiologie médicale de l’Université de Zurich, et Gonzalo Cebrero du Biozentrum de l’Université de Bâle pour leur collaboration dans la génération de nanocorps synthétiques (corps sybodies). Nous remercions Maria Barthmes et André Bazzone de NANION Technologies pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse (FNS) (PP00P3_170607 et NANION Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
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