Selectie van transporter-gerichte remmende nanobodies door solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie
Summary
Nanobodies zijn belangrijke hulpmiddelen in de structurele biologie en vormen een groot potentieel voor de ontwikkeling van therapieën. De selectie van nanobodies met remmende eigenschappen kan echter een uitdaging zijn. Hier demonstreren we het gebruik van solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie voor de classificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene membraantransporters.
Abstract
Single domain antilichamen (nanobodies) zijn op grote schaal gebruikt in mechanistische en structurele studies van eiwitten en ze vormen een enorm potentieel als hulpmiddelen voor het ontwikkelen van klinische therapieën, waarvan er vele afhankelijk zijn van de remming van membraaneiwitten zoals transporters. De meeste methoden die worden gebruikt om de remming van transportactiviteit te bepalen, zijn echter moeilijk uit te voeren in routines met hoge doorvoer en zijn afhankelijk van de beschikbaarheid van gelabelde substraten, waardoor de screening van grote nanobodybibliotheken wordt bemoeilijkt. Solid-supported membrane (SSM) elektrofysiologie is een high-throughput methode, gebruikt voor het karakteriseren van elektrogene transporters en het meten van hun transportkinetiek en remming. Hier tonen we de implementatie van SSM-gebaseerde elektrofysiologie om remmende en niet-remmende nanobodies te selecteren die zich richten op een elektrogene secundaire transporter en om nanobodies remmende constanten te berekenen. Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor het selecteren van remmende nanobodies gericht op transporters waarvoor geen gelabelde substraten beschikbaar zijn.
Introduction
Antilichamen bestaan uit twee identieke zware ketens en twee lichte ketens die verantwoordelijk zijn voor de antigeenbinding. Kameelachtigen hebben alleen antilichamen met een zware keten die vergelijkbare affiniteit vertonen voor hun verwante antigeen in vergelijking met conventionele antilichamen1,2. Het single variable domain (VHH) van heavy-chain only antilichamen behoudt de volledige antigeenbindende potentiaal en is zeer stabielgebleken 1,2. Deze geïsoleerde VHH-moleculen of “nanobodies” zijn geïmplementeerd in studies met betrekking tot de biochemie van membraaneiwitten als hulpmiddelen voor het stabiliseren van conformaties3,4,alsremmers 5,6,als stabilisatiemiddelen7en als gadgets voor structuurbepaling8,9,10 . Nanobodies kunnen worden gegenereerd door de immunisatie van kameelachtigen voor de voorverrijking van B-cellen die coderen voor doelspecifieke nanobodies en daaropvolgende isolatie van B-cellen, gevolgd door het klonen van de nanobody-bibliotheek en selectie door faagweergave11,12,13. Een alternatieve manier om nanobodies te genereren is gebaseerd op in vitro selectiemethoden die afhankelijk zijn van de constructie van bibliotheken en selectie door faagweergave, ribosoomweergave of gistweergave14,15,16,17,18,19,20. Deze in vitro methoden vereisen grote bibliotheekgroottes, maar profiteren van het vermijden van dierlijke immunisatie en geven de voorkeur aan de selectie van nanobodies gericht op eiwitten met een relatief lage stabiliteit.
De kleine omvang van nanobodies, hun hoge stabiliteit en oplosbaarheid, sterke antigeenaffiniteit, lage immunogeniciteit en relatief eenvoudige productie, maken ze sterke kandidaten voor de ontwikkeling van therapeutica21,22,23. Met name nanobodies die de activiteit van meerdere membraaneiwitten remmen, zijn potentiële activa voor klinische toepassingen5,24,25,26. In het geval van membraantransporters is het, om te evalueren of een nanolichaam remmende activiteit heeft, noodzakelijk om een test te ontwikkelen die de detectie van getransporteerde substraten en /of co-substraten mogelijk maakt. Dergelijke testen omvatten meestal gelabelde moleculen of het ontwerp van substraatspecifieke detectiemethoden, die mogelijk geen universele toepassing hebben. Bovendien vereist de identificatie van remmende nanobodies over het algemeen de screening van grote aantallen bindmiddelen. Een methode die kan worden gebruikt in een high-throughput-modus en die niet afhankelijk is van gelabelde substraten is dus essentieel voor deze selectie.
SSM-gebaseerde elektrofysiologie is een uiterst gevoelige, zeer tijd-opgeloste techniek die de detectie van beweging van ladingen over membranen (bijv. Ionbinding / transport) mogelijk maakt27,28. Deze techniek is toegepast om elektrogene transporters te karakteriseren, die moeilijk te bestuderen zijn met behulp van andere elektrofysiologische technieken vanwege de relatief lage omzet van deze eiwitten29,30,31,32,33,34,35. SSM-elektrofysiologie vereist geen gebruik van gelabelde substraten, het is geschikt voor screening met hoge doorvoer en proteoliposomen of membraanblaasjes met de transporter van belang kunnen worden gebruikt. Hier tonen we aan dat op SSM gebaseerde elektrofysiologie kan worden gebruikt om transporter-gerichte nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen te classificeren. Als proof-of-principle beschrijven we de reconstitutie van een bacteriële cholinetransporter in liposomen, gevolgd door gedetailleerde stappen voor immobilisatie van proteoliposomen op de SSM-sensoren. Vervolgens beschrijven we hoe op SSM gebaseerde elektrofysiologische metingen van cholinetransport kunnen worden uitgevoerd en hoe de half-maximale effectieve concentratie kan worden bepaald (EC50). Vervolgens laten we zien hoe we op SSM gebaseerde elektrofysiologie kunnen gebruiken om meerdere nanobodies te screenen en remmers van cholinetransport te identificeren. Ten slotte beschrijven we hoe de half maximale remmende concentraties (IC50) van geselecteerde remmende nanobodies kunnen worden bepaald.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde techniek classificeert nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen gericht op elektrogene transporters. Het beoordelen van het substraattransport is mogelijk door de detectie van de beweging van ladingen door de transporter ingebed in het membraan van proteoliposomen. Enkele van de kritieke stappen tijdens het opzetten van een experiment zijn reconstitutie van actief eiwit in liposomen, voorbereiding van stabiele monolagen op SSM-chips en herstel van de begincondities na de toepassing va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Cedric A. J. Hutter en Markus A. Seeger van het Instituut voor Medische Microbiologie aan de Universiteit van Zürich, en Gonzalo Cebrero van Biozentrum van de Universiteit van Basel voor de samenwerking bij het genereren van synthetische nanobodies (sybodies). Wij danken Maria Barthmes en Andre Bazzone van NANION Technologies voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 en NANION Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
