اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية
Summary
الأجسام النانوية هي أدوات هامة في البيولوجيا الهيكلية وتشكل إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات. ومع ذلك ، فإن اختيار الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة يمكن أن يكون تحديا. هنا نظهر استخدام الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على علم الفيزيولوجيا الكهربية لتصنيف الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقلات الأغشية الكهربائية.
Abstract
وقد استخدمت الأجسام المضادة مجال واحد (الأجسام النانوية) على نطاق واسع في الدراسات الميكانيكية والهيكلية للبروتينات وأنها تشكل إمكانات هائلة كأدوات لتطوير العلاجات السريرية، وكثير منها يعتمد على تثبيط البروتينات الغشائية مثل الناقلين. ومع ذلك، فإن معظم الأساليب المستخدمة لتحديد تثبيط نشاط النقل يصعب تنفيذها في إجراءات عالية الإنتاجية وتعتمد على توافر الركائز المسماة وبالتالي تعقيد فحص مكتبات الأجسام النانوية الكبيرة. الغشاء المدعوم بصلابة (SSM) علم الفيزيولوجيا الكهربية هو وسيلة عالية الإنتاجية، وتستخدم لوصف الناقلين الكهربائي وقياس الحركية النقل وتثبيط. هنا نعرض تنفيذ الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لاختيار الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقل ثانوي كهربائي لحساب الثوابت المثبطة للأجسام النانوية. قد تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لاختيار الأجسام النانوية المثبطة التي تستهدف الناقلين والتي لا تتوفر لها ركائز تحمل علامة.
Introduction
تتكون الأجسام المضادة من سلسلتين ثقيلتين متطابقتين وسلاسل خفيفة مسؤولة عن ربط المستضد. Camelids والأجسام المضادة الثقيلة السلسلة فقط التي تظهر تقارب مماثلة لمضاد cognate مقارنة مع الأجسام المضادة التقليدية1،2. المجال المتغير واحد (VHH) من الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة فقط الاحتفاظ الكامل مستضد ملزمة المحتملة، وقد ثبت أن تكون مستقرة جدا1،2. وقد تم تنفيذ هذه الجزيئات VHH معزولة أو “الأجسام النانوية” في الدراسات المتعلقة البروتينات الغشاء الكيمياء الحيوية كأدوات لتثبيت الهيئات3،4، ومثبطات5،6، وعوامل تثبيت7، وكأدوات لتحديد هيكل8،9،10 . يمكن توليد الأجسام النانوية عن طريق تحصين camelids للتخصيب المسبق للخلايا B التي تشفر الأجسام النانوية الخاصة بالهدف والعزلة اللاحقة للخلايا B ، يليها استنساخ مكتبة الأجسام النانوية والاختيار عن طريق عرض phage11و12و13. ويستند وسيلة بديلة لتوليد الأجسام النانوية على أساليب اختيار في المختبر التي تعتمد على بناء المكتبات والاختيار عن طريق عرض phage، عرض الريبوسوم، أو عرض الخميرة14،15،16،17،18،19،20. تتطلب هذه الطرق في المختبر أحجام مكتبة كبيرة ولكنها تستفيد من تجنب تحصين الحيوانات وتفضل اختيار الأجسام النانوية التي تستهدف البروتينات ذات الاستقرار المنخفض نسبيا.
صغر حجم الأجسام النانوية، واستقرارها العالي وقابليتها للذوبان، وتقارب مستضد قوي، وانخفاض المناعة، وإنتاج سهل نسبيا، وجعلها مرشحة قوية لتطوير العلاجات21،22،23. على وجه الخصوص ، الأجسام النانوية التي تمنع نشاط بروتينات الأغشية المتعددة هي أصول محتملة للتطبيقات السريرية5،24،25،26. في حالة ناقلات الأغشية ، لتقييم ما إذا كان الجسم النانوي لديه نشاط مثبط ، من الضروري تطوير فحص يسمح بالكشف عن الركائز المنقولة و / أو الركائز المشتركة. وعادة ما تنطوي هذه المقايسات على جزيئات تحمل علامات أو تصميم أساليب كشف خاصة بالركيزة، والتي قد تفتقر إلى تطبيق عالمي. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد الأجسام النانوية المثبطة يتطلب عموما فحص أعداد كبيرة من الموثقات. وبالتالي، أسلوب يمكن استخدامه في وضع الإنتاجية العالية و التي لا تعتمد على الركائز المسماة ضروري لهذا التحديد.
الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM هي تقنية حساسة للغاية ، تم حلها زمنيا للغاية تسمح باكتشاف حركة الشحنات عبر الأغشية (على سبيل المثال ، ربط / نقل الأيونات)27،28. وقد تم تطبيق هذه التقنية لتوصيف الناقلين الكهربائي، والتي يصعب دراستها باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الأخرى بسبب الدوران المنخفض نسبيا لهذه البروتينات29و30و31و32و33و34و35. لا يتطلب علم الفيزيولوجيا الكهربية SSM استخدام الركائز المسماة ، بل هو مناسب لفحص عالي الإنتاجية ، ويمكن استخدام البروتيوليبوبوسومات أو الحويصلات الغشائية التي تحتوي على الناقل المثير للاهتمام. هنا، ونحن نثبت أن الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM يمكن استخدامها لتصنيف الأجسام النانوية الموجهة للنقل مع خصائص مثبطة وغير مثبطة. كدليل على المبدأ, ونحن نصف إعادة تشكيل ناقل الكولين البكتيرية في الليبوسومات, تليها خطوات مفصلة لشل حركة البروتيوليبوسومات على أجهزة الاستشعار SSM. ونحن بعد ذلك وصف كيفية أداء القياسات الكهربية القائمة على SSM للنقل الكولين وكيفية تحديد تركيز فعال نصف القصوى (EC50). ثم نعرض كيفية استخدام الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لفحص الأجسام النانوية المتعددة وتحديد مثبطات نقل الكولين. وأخيرا، فإننا نصف وصف كيفية تحديد تركيزات المثبطة نصف القصوى (IC50)من الأجسام النانوية المثبطة مختارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتصنف التقنية المعروضة هنا الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف الناقلين الكهربائيين. تقييم النقل الركيزة ممكن بسبب الكشف عن حركة الشحنات من خلال الناقل جزءا لا يتجزأ من غشاء البروتيوليبوسومات. بعض الخطوات الحاسمة أثناء إعداد تجربة هي إعادة تشكيل البروتين النش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سيدريك أ. ج. هوتر وماركوس أ. سيغر من معهد علم الأحياء المجهرية الطبية في جامعة زيوريخ، وغونزالو سيبريرو من Biozentrum من جامعة بازل للتعاون في توليد الأجسام النانوية الاصطناعية (الأجسام). نشكر ماريا بارتمز وأندريه بازون من شركة نانيون تكنولوجيز على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (PP00P3_170607 ومبادرة منحة البحوث التي قدمتها مؤسسة نانيون إلى مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
