Анализ многофакторных экспериментов с РНК-Seq с помощью DiCoExpress

Технология секвенирования РНК следующего поколения (RNA-Seq) в настоящее время является золотым стандартом анализа транскриптома¹. С первых дней существования технологии совместные усилия биоинформатиков и биостатистиков привели к разработке многочисленных методов, охватывающих все основные этапы транскриптомного анализа, от картирования до количественной оценки транскриптов². Большинство инструментов, доступных сегодня биологу, разработаны в программной среде R для статистических вычислений и графиков³, а многие пакеты для анализа биологических данных доступны в репозитории Bioconductor⁴. Эти пакеты предлагают полный контроль и настройку анализа, но они приходят за счет широкого использования интерфейса командной строки. Поскольку многие биологи более комфортно относятся к подходу «укажи и^{щелкни» 5}, демократизация анализа РНК-Seq требует разработки более удобных интерфейсов или протоколов⁶. Например, можно создавать веб-интерфейсы пакетов R с помощью Shiny⁷, а анализ данных командной строки становится более интуитивно понятным с интерфейсом R-studio⁸ . Разработка специализированных, пошаговых учебников также может помочь новому пользователю. В частности, видеоурок дополняет классический текстовый, что приводит к более глубокому пониманию всех этапов процедуры.

Недавно мы разработали DiCoExpress⁹, инструмент для анализа многофакторных экспериментов RNA-Seq в R с использованием методов, которые считаются лучшими, основанными на нейтральных сравнительных исследованиях 10,11,12. Начиная с таблицы подсчета, DiCoExpress предлагает этап контроля качества данных, за которым следует дифференциальный анализ экспрессии генов (пакет^{edgeR 13}) с использованием обобщенной линейной модели (GLM) и генерация кластеров коэкспрессии с использованием моделей смеси Гаусса (пакет coseq¹²). DiCoExpress обрабатывает полную и несбалансированную конструкцию до 2 биологических факторов (т.е. генотип и лечение) и одного технического фактора (т.е. репликация). Оригинальность DiCoExpress заключается в архитектуре каталогов, хранящей и организующей данные, скрипты и результаты, а также в автоматизации записи контрастов, позволяющей пользователю исследовать многочисленные вопросы в рамках одной статистической модели. Была также предпринята попытка представить графические результаты, иллюстрирующие статистические результаты.

Рабочая область DiCoExpress доступна по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Он содержит четыре каталога, два PDF и два текстовых файла. Каталог Data/ содержит входные наборы данных; для этого протокола мы будем использовать набор данных “tutorial”. Каталог Sources/ содержит семь функций R, необходимых для выполнения анализа, и не должен быть изменен пользователем. Анализ выполняется с использованием скриптов, хранящихся в каталоге Template_scripts/. Тот, который используется в этом протоколе, называется DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R и может быть легко адаптирован к любому транскриптомному проекту. Все результаты записываются в каталог Results/ и хранятся в подкаталоге, названном в соответствии с проектом. Файл README.md содержит полезную информацию об установке, а любые конкретные сведения о методе и его использовании можно найти в файле DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.

Этот видеоурок проводит пользователя через различные функции DiCoExpress с целью преодоления нежелания, испытываемого биологами с помощью инструментов на основе командной строки. Здесь мы представляем анализ искусственного набора данных RNA-Seq, описывающего экспрессию генов в трех биологических репликатах четырех генотипов, с лечением или без него. Теперь мы рассмотрим различные этапы рабочего процесса DiCoExpress, показанные на рисунке 1. Скрипт, описанный в разделе Протокол, и входные файлы доступны на сайте: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress

Подготовка файлов данных
Четыре CSV-файла, хранящиеся в каталоге Data/, должны быть названы в соответствии с именем проекта. В нашем примере все имена, следовательно, начинаются с «Tutorial», и мы установим Project_Name = «Tutorial» на шаге 4 протокола. Разделитель, используемый в CSV-файлах, должен быть указан в переменной Sep на шаге 4. В нашем наборе данных “tutorial” разделителем является табуляция. Для опытных пользователей полный набор данных можно свести к подмножеству, предоставив список инструкций и новую Project_Name через переменную Filter. Этот параметр позволяет избежать избыточных копий входных файлов и проверяет принципы FAIR¹⁴.

Среди четырех CSV-файлов обязательными являются только файлы COUNTS и TARGET. Они содержат необработанные подсчеты для каждого гена (здесь Tutorial_COUNTS.csv) и описание экспериментального дизайна (здесь Tutorial_TARGET.csv). Файл TARGET.csv описывает каждый образец (один образец на строку) с модальностью для каждого биологического или технического фактора (в столбцах). Мы настоятельно рекомендуем, чтобы имена, выбранные для модальностей, начинались с буквы, а не с цифры. Имя последнего столбца (“Репликатировать”) изменить нельзя. Наконец, имена образцов (первый столбец) должны совпадать с именами в заголовках файла COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 в нашем примере). Файл Enrichment.csv, в котором каждая строка содержит один Gene_ID и один термин аннотации, требуется только в том случае, если пользователь планирует выполнить анализ обогащения. Если один ген имеет несколько аннотаций, их придется писать разными строками. Файл Annotation.csv является необязательным и используется для добавления краткого описания каждого гена в выходные файлы. Лучший способ получить файл аннотации – получить информацию из выделенных баз данных (например, Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do для Arabidopsis).

Установка ДиКоЭкспресс
Для DiCoExpress требуются специальные пакеты R. Используйте источник командной строки(“.. /Sources/Install_Packages.R”) в консоли R для проверки состояния установки требуемого пакета. Для пользователей Linux другим решением является установка контейнера, предназначенного для DiCoExpress и доступного по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. По определению, этот контейнер содержит DiCoExpress со всеми необходимыми частями, такими как библиотеки и другие зависимости.