זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי
Summary
כפי שמיושם כיום, אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים דורשת הזרקה של וקטורים נגיפיים למוח. שיטת הזרקה אופטימלית צריכה להיות אמינה, ועבור יישומים רבים, מסוגלת להתמקד באתרים בודדים בעלי עומק שרירותי המזוהים בקלות ובאופן חד משמעי בהיסטולוגיה שלאחר המוות. שיטת הזרקה עם תכונות אלה מוצגת.
Abstract
טכניקות אופטוגנטיות חוללו מהפכה במחקר במדעי המוח ועומדות לעשות את אותו הדבר עבור ריפוי גנטי נוירולוגי. השימוש הקליני באופטוגנטיקה, לעומת זאת, מחייב להדגים בטיחות ויעילות במודלים של בעלי חיים, באופן אידיאלי בפרימטים שאינם בני אדם (NHPs), בגלל הדמיון הנוירולוגי שלהם לבני אדם. מספר הווקטורים המועמדים שעשויים להיות שימושיים למדעי המוח ולרפואה הוא עצום, ועדיין לא קיים אמצעי בעל תפוקה גבוהה לבדיקת וקטורים אלה. לפיכך, יש צורך בטכניקות לביצוע הזרקות מדויקות מרחבית ונפחית של וקטורים ויראליים למוח NHP שניתן לזהות באופן חד משמעי באמצעות היסטולוגיה שלאחר המוות. המתוארת כאן היא שיטה כזו. צינוריות הזרקה בנויות מצינורות פוליטטרפלואורואתילן מצומדים וצינורות נירוסטה. צינוריות אלה הן אוטו-קלביות, חד-פעמיות ובעלות נפחי טעינה מינימליים נמוכים, מה שהופך אותן לאידיאליות להזרקת תמיסות וקטוריות ויראליות יקרות ומרוכזות מאוד. שמן מינרלי אינרטי, צבוע באדום, ממלא את החלל המת ויוצר מניסקוס נראה לעין עם התמיסה הווקטורית, המאפשר מדידה מיידית ומדויקת של קצבי ההזרקה ונפחים. השמן נטען לחלק האחורי של הצינורית, מה שמקטין את הסיכון להזרקה משותפת עם הווקטור. ניתן לטעון צינוריות תוך 10 דקות, וניתן לבצע זריקות תוך 20 דקות. הליך זה מתאים היטב להזרקות לבעלי חיים ערים או מורדמים. כאשר משתמשים בו כדי לספק וקטורים ויראליים באיכות גבוהה, הליך זה יכול לייצר ביטוי חזק של חלבונים אופטוגנטיים, ומאפשר שליטה אופטית על הפעילות וההתנהגות העצבית ב- NHPs.
Introduction
אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים (NHPs) כוללת בדרך כלל הזרקה של וקטור נגיפי ישירות למוח. מחלקה אחת של וקטורים המתאימה היטב ליישום זה מבוססת על וירוס הקשור לאדנו (AAV). וקטורים אלה מורכבים מקפסיד חלבוני המקיף גנום דנ”א חד-גדילי, אשר בתורו מורכב ממקדם, גן אופסין, ובאופן אופציונלי, אלמנטים אחרים של קידוד חלבונים וויסות גנים. ההתקדמות בשיבוט מולקולרי הקלה על מניפולציה ושילוב של רכיבים אלה לפיתוח וקטורים חדשים. כתוצאה מכך, אוסף וקטורי AAV שעשויים להיות שימושיים עבור אופטוגנטיקה של NHP הוא גדול וגדל במהירות.
כיום, התועלת של וקטור AAV עבור אופטוגנטיקה של NHP דורשת בדיקה in vivo. עובדה זו מהווה חסם משמעותי להתקדמות. יש להשתמש בבעלי חיים במשורה, ובדיקת וקטורים מרובים בחיה אחת דורשת שאתרי ההזרקה ימוקמו באופן מושכל יחסית לארכיטקטורה העצבית ומופרדים היטב ביחס להתפשטות הנגיף. הערכה היסטולוגית מדויקת דורשת שהזריקות יהיו מדויקות מבחינה מרחבית ונפחית. טכניקת הזרקה ששימשה בעבר למשלוח מוקדי של חומרים פרמקולוגיים 1,2,3,4 הותאמה ופשטה לביצוע זריקות כאלה. טכניקת הזרקה זו היא זולה, משתמשת ברכיבים חד פעמיים ומעוקרים, ניתן להשתמש בה בקופים מורדמים או ערים, וניתן להשתמש בה כדי להתמקד באזורי מוח מגוונים בכל עומק. הפרוטוקול הבא מתאר נהלים שלב אחר שלב לייצור הרכיבים החד פעמיים וביצוע זריקות במוח NHP. היתרונות והחסרונות של הטכניקה נדונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקדמות באופטוגנטיקה של NHP יצרה צורך בשיטות הזרקה תוך גולגולתיות מדויקות ואמינות. היתרונות של השיטה המתוארת בדו”ח זה הם שהיא זולה, משתמשת ברכיבים מעוקרים וחד פעמיים, ובעלת יכולת להתמקד באזורי מוח מגוונים בכל עומק. זה גם מאפשר שליטה על מהירות ההזרקה ונפח בזכות המהירות שבה ניתן לשלוט בשסתום האוויר. ניתן להגביר את לחץ האוויר באופן חולף כדי לעקור סתימה ולאחר מכן להפחית במהירות כדי למנוע הזרקת יתר לאחר מכן שתיווצר על ידי לחץ מתמשך. רכיבים חד פעמיים מפחיתים את הסיכון לזיהום צולב בין אתרי ההזרקה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול ההזרקה זה כוללים בניית צינוריות איכותיות, העמסתן ללא החדרת בועות ובחירת אתרי הזרקה שאינם קרובים מדי זה לזה. זריקות בהפרש של ≥1 ס”מ בדרך כלל מתמרת אזורים שאינם חופפים, אך היוריסטיקה זו תלויה בסרוטיפ ויראלי, טיטר, מקדם, נפח, מטרה ושיטת זיהוי. בחירת אתרי הזרקה שאינם מחוברים ישירות מונעת בלבולים פוטנציאליים המיוצרים על ידי סחר באופסין לאורך אקסונים ואת הנטייה של חלק מהסרוטיפים של AAV להתמרה מדרדרת.
השיטה יכולה לשמש להזרקת NHPs בזמן שהם מורדמים ובמסגרת סטריאוטקסית (איור 3) או בהתראה ובראש קבוע (איור 4). לראשון יש יתרון בכך שהוא מאפשר לזריקות להיות ממוקדות בקואורדינטות סטריאוטקסיות, והוא מאפשר אישור חזותי לחדירת צינורית דרך דורוטומיה חריפה (חיתוך הדורה בקוף ער, באמצעות קרניוטומיית כרונית, מעלה את הסיכון לזיהום). לגישה השנייה יש את היתרונות של הפחתת מספר ניתוחי ההישרדות ולכן הלחץ על החיה, להיות תואם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במהלך ההתנהגות, ושימוש באותה מסגרת קואורדינטות ומכשור המשמש להחדרת סיבים אופטיים לניסויים לאחר הזרקה. ניתן לשפר עוד יותר את טכניקת ההזרקה בקופים ערים על ידי ביצוע הזרקות באמצעות דורה מלאכותית13,14,15. זה יעניק את היתרונות הנוספים של הדמיה ישירה של אתרי הזרקה ואת פלואורסצנטיות הרקמה המצביעה על התמרה מוצלחת.
מספר טכניקות הזרקת AAV אחרות שימשו ב- NHPs. לאחרונה פותח מכשיר הזרקה רב-ערוצי כדי לספק וקטורים של AAV באופן אחיד לאזורים גדולים בקליפת המוח של NHP16. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות הסעה משופרת משלוח17,18. שיטות אלה שואפות למקסם את התפשטות ההתמרת, שהיא מטרה חשובה אך שונה מהדיוק המרחבי שהשיטה שלנו שואפת להשיג.
שיטה חלופית נוספת היא להזריק וקטורים של AAV דרך צינורות בורוסיליקט המשופעים לקצה חד בקצה אחד ומחוברים למזרק המילטוןבקצה השני 5,6. לשיטה זו יש הרבה מן המשותף עם השיטה המתוארת במאמר זה. הווקטור הוויראלי מוחזק באורך של צינורות, החלל בצינורות שמאחורי הנגיף מלא בשמן צבוע, וזרימת הווקטור מנוטרת באמצעות תנועת המניסקוס וקטור השמן. טכניקה חלופית זו דורשת פחות ציוד והכנה, אך היא דורשת משיכת שמן לתוך צינורות הבורוסיליקט דרך הקצה המשופע בלחץ שלילי והעמסת הווקטור דרך אותו מסלול לאחר מכן. התוצאה היא בהכרח עקבות של שמן המועברים למוח. בנוסף, מניסיוננו, צינורות הבורוסיליקט חייבים להיות בקוטר של ~350 מיקרומטר כדי לחדור לדורה גם כאשר הם משופעים ולכן גורמים לנזק מכני גדול יותר מאשר צינורית המתכת הדקה יותר המתוארת במאמר זה (איור 2D). צינורות 30 G שימשו מכיוון שעומס האבזם הקריטי שלו גבוה מספיק כדי לתווך חדירת דורה למרות אורכו 1-10 ס”מ, מכיוון שהוא מתאים לצינורות PTFE בחוזקה, ומכיוון שהוא כמעט ולא נחסם. צינורות 33 G נסתמים ומתכופפים בקלות רבה יותר וקשה יותר להזדווג עם צינורות PTFE. צינורות 36 G אינם נוקשים מספיק כדי לחדור ל-NHP dura mater.
טכניקת הזרקה חלופית נוספת היא לחבר את הפלט של משאבת האוויר לחלק האחורי של פיפטה19 טעונה וקטורית, זכוכית משוכת. הווקטור נאלץ מקצה הפיפטה על ידי לחץ אוויר ישיר, לסירוגין מהמשאבה, ומבטל את הצורך בשמן. בדומה לשיטת הצינור הבודד שהוסברה לעיל, היעדר צמתים חומריים בין המניסקוס לקצה הצינורית מקטין את הסיכון לדליפות. עם זאת, הקצוות המחודדים החדים והעדינים של פיפטות הזכוכית מונעים מהם לחדור לדורת NHP או לפגוע במבנים עמוקים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), מענקי המכון הלאומי לבריאות (NIH) EY023277 (R01 עבור YK), EY030441 (R01 עבור GH), MH114126 (RF1 ל-JTT, בועז לוי, אד ליין), MH120095 (UG3 עבור JTT ו-GH), EY028902 (R01 עבור RS), והתאפשר הודות למענקי NIH OD010425 (P51 עבור WaNPRC) וקרן מחקר התמלוגים של אוניברסיטת וושינגטון A148416. המחברים רוצים להודות ליסמין אל-שמאיילה וויקטוריה אומסטד על ההיסטולוגיה, לרפוחיו מרטינז על שיבוט וקטורים ויראליים, ולג’ון מיץ’ על הסיוע בעיבוד רקמות המוח של NHP.
Materials
| Equipment: Stereotaxic set | |||
| Item | |||
| Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
| Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
| Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
| Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
| Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
| Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
| Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
| Equipment: Cannula | |||
| Item | |||
| 1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
| Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
| Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
| Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
| Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
| Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
| P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
| PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
| Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
| Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
| Vector solution | (homemade) | NA | NA |
| Equipment: Electric air pump set | |||
| Item | |||
| Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
| Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
| Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
| Equipment: General surgery tools | |||
| Item | |||
| Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
| Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
| Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
| Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
| Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
| Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
| Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
| Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
| Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
| Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
| Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
| Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
| Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
| Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
| Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
| Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
| Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
| Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
| Suction | medela | 200-4869 | NA |
| Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
| Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
| Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
| Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
| Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
| Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
| Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
| Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
| Equipment: *cannulas | |||
| Item | |||
| Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
| Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
| PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
| Equipment: **colored oil | |||
| Item | |||
| Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
| Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
| STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma | |||
References
- Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades. Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).
- Kojima, Y., Soetedjo, R. Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades. Brain Research. 1366, 93-100 (2010).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation. Brain Research. 1401, 30-39 (2011).
- De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons. eLife. 9, 52658 (2020).
- El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum. Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).
- Mich, J. K., et al. Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex. Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).
- Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling. Neuron. (21), 00159 (2020).
- Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. Obstacle stepping in patients with Parkinson’s disease. Complexity does influence performance. Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).
- Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning. Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).
- Kleinbart, J. E., et al. A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).
- Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Fredericks, J. M., et al. Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
