حقن ناقلات AAV لعلم البصريات الوراثي في الدماغ الرئيسيات غير البشرية المخدر والمستيقظ
Summary
وكما هو مطبق حاليا، فإن علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية يتطلب حقن النواقل الفيروسية في الدماغ. يجب أن تكون طريقة الحقن المثلى موثوقة ، وبالنسبة للعديد من التطبيقات ، قادرة على استهداف المواقع الفردية ذات العمق التعسفي التي يتم تحديدها بسهولة وبشكل لا لبس فيه في علم الأنسجة بعد الوفاة. يتم تقديم طريقة حقن مع هذه الخصائص.
Abstract
أحدثت التقنيات البصرية الجينية ثورة في أبحاث علم الأعصاب وهي على وشك أن تفعل الشيء نفسه في العلاج الجيني العصبي. ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لعلم البصريات الوراثي يتطلب إثبات السلامة والفعالية في النماذج الحيوانية ، ومن الناحية المثالية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) ، بسبب تشابهها العصبي مع البشر. عدد المتجهات المرشحة التي يحتمل أن تكون مفيدة لعلم الأعصاب والطب هائل ، ولا توجد حتى الآن وسائل عالية الإنتاجية لاختبار هذه النواقل. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات لإجراء حقن متعددة دقيقة مكانيا وحجميا للناقلات الفيروسية في دماغ NHP والتي يمكن تحديدها بشكل لا لبس فيه من خلال علم الأنسجة بعد الوفاة. الموصوفة هنا هي مثل هذه الطريقة. يتم تصنيع قنيات الحقن من أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين وأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ. هذه القنيبات قابلة للتعقيم ، ويمكن التخلص منها ، ولها أحجام تحميل منخفضة ، مما يجعلها مثالية لحقن محاليل ناقلات فيروسية باهظة الثمن وعالية التركيز. يملأ الزيت المعدني الخامل المصبوغ باللون الأحمر المساحة الميتة ويشكل غضروفا مفصليا مرئيا بمحلول متجه ، مما يسمح بقياس فوري ودقيق لمعدلات الحقن وأحجامه. يتم تحميل الزيت في الجزء الخلفي من القنية ، مما يقلل من خطر الحقن المشترك مع الناقل. يمكن تحميل Cannulas في 10 دقائق ، ويمكن إجراء الحقن في 20 دقيقة. هذا الإجراء مناسب تماما للحقن في الحيوانات المستيقظة أو المخدرة. عند استخدامه لتقديم ناقلات فيروسية عالية الجودة ، يمكن أن ينتج هذا الإجراء تعبيرا قويا عن البروتينات البصرية الجينية ، مما يسمح بالتحكم البصري في النشاط العصبي والسلوك في NHPs.
Introduction
عادة ما ينطوي علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) على حقن الناقل الفيروسي مباشرة في الدماغ. تعتمد فئة واحدة من النواقل المناسبة تماما لهذا التطبيق على الفيروس المرتبط بالغدي (AAV). تتكون هذه النواقل من قفيصة بروتين تحيط بجينوم الحمض النووي أحادي الخيط الذي يتكون بدوره من مروج ، وجين أوبسين ، واختياريا ، عناصر أخرى لترميز البروتين وتنظيم الجينات. وقد يسر التقدم المحرز في الاستنساخ الجزيئي التلاعب بهذه المكونات والجمع بينها من أجل تطوير ناقلات جديدة. وبالتالي ، فإن مجموعة ناقلات AAV التي يحتمل أن تكون مفيدة ل NHP البصريات الوراثية كبيرة وتنمو بسرعة.
في الوقت الحاضر ، تتطلب فائدة ناقل AAV لعلم البصريات الوراثي NHP الاختبار في الجسم الحي. وتشكل هذه الحقيقة عائقا كبيرا أمام التقدم. يجب استخدام الحيوانات بشكل مقتصد ، ويتطلب اختبار ناقلات متعددة في واحد وضع مواقع الحقن بحكمة بالنسبة للبنية العصبية وفصلها جيدا بالنسبة لانتشار الفيروس. يتطلب التقييم النسيجي الدقيق أن تكون الحقن دقيقة مكانيا وحجميا. تم تكييف تقنية الحقن المستخدمة سابقا للتوصيل البؤري للعوامل الدوائية1،2،3،4 وتبسيطها لإجراء مثل هذه الحقن. تقنية الحقن هذه غير مكلفة ، وتستخدم مكونات يمكن التخلص منها وتعقيمها ، ويمكن استخدامها في القرود المخدرة أو المستيقظة ، ويمكن استخدامها لاستهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. يصف البروتوكول التالي الإجراءات خطوة بخطوة لتصنيع المكونات التي يمكن التخلص منها وإجراء الحقن في دماغ NHP. تتم مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدى التقدم في علم البصريات الوراثي NHP إلى خلق حاجة إلى طرق حقن دقيقة وموثوقة داخل الجمجمة. مزايا الطريقة الموصوفة في هذا التقرير هي أنها غير مكلفة ، وتستخدم مكونات معقمة ويمكن التخلص منها ، ولديها القدرة على استهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. كما يسمح بالتحكم في سرعة الحقن وحجمه بحكم السرعة التي يمكن بها التحكم في صمام الهواء. يمكن زيادة ضغط الهواء بشكل عابر لإزاحة انسداد ثم تقليله بسرعة لتجنب الإفراط في الحقن اللاحق الذي قد ينتج عن الضغط المستمر. تقلل المكونات التي تستخدم لمرة واحدة من خطر التلوث المتبادل بين مواقع الحقن.
تشمل الخطوات الحاسمة في بروتوكول الحقن هذا بناء قنيات عالية الجودة ، وتحميلها دون إدخال فقاعات ، واختيار مواقع الحقن التي ليست قريبة جدا من بعضها البعض. عادة ما تؤدي الحقن التي ≥1 سم إلى نقل مناطق غير متداخلة ، ولكن هذا الاستدلال يعتمد على النمط المصلي الفيروسي ، والعيار ، والمروج ، والحجم ، والهدف ، وطريقة الكشف. إن اختيار مواقع الحقن غير المتصلة مباشرة يتجنب الارتباكات المحتملة الناتجة عن الاتجار بالأوبسين على طول المحاور العصبية وميل بعض الأنماط المصلية AAV للنقل الرجعي.
يمكن استخدام هذه الطريقة لحقن NHPs أثناء التخدير وفي إطار مجسمة (الشكل 3) أو تنبيه وتثبيت الرأس (الشكل 4). الأول لديه ميزة السماح باستهداف الحقن في إحداثيات مجسمة ، ويسمح بتأكيد بصري لاختراق القنية من خلال استئصال القرنية الحاد (شق الجافية في مستيقظ ، من خلال بضع القحف المزمن ، يزيد من خطر العدوى). يتميز النهج الأخير بمزايا تقليل عدد جراحات البقاء على قيد الحياة وبالتالي الضغط على الحيوان ، كونه متوافقا مع التسجيلات الكهروفسيولوجية أثناء السلوك ، واستخدام نفس الإطار الإحداثي والأجهزة المستخدمة لإدخال الألياف البصرية لتجارب ما بعد الحقن. يمكن تحسين تقنية الحقن في القرود المستيقظة عن طريق إجراء الحقن من خلال الجافية الاصطناعية13،14،15. وهذا من شأنه أن يمنح مزايا إضافية للتصور المباشر لمواقع الحقن وتألق الأنسجة الذي يشير إلى النقل الناجح.
تم استخدام العديد من تقنيات حقن AAV الأخرى في NHPs. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز حقن متعدد القنوات لتوصيل ناقلات AAV بشكل موحد إلى المناطق القشرية NHP الكبيرة16. يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام التسليم المعزز بالحمل الحراري17,18. تهدف هذه الطرق إلى زيادة انتشار النقل إلى أقصى حد ، وهو هدف مهم ولكنه يختلف عن الدقة المكانية التي تهدف طريقتنا إلى تحقيقها.
طريقة بديلة أخرى هي حقن ناقلات AAV من خلال أنابيب البورسليكات التي يتم شطبها إلى طرف حاد على أحد طرفيها وربطها بحقنة هاميلتون علىالطرف الآخر 5,6. هذه الطريقة لديها الكثير من القواسم المشتركة مع الطريقة الموضحة في هذه الورقة. يتم الاحتفاظ بالناقل الفيروسي في طول الأنابيب ، ويتم ملء المساحة الموجودة في الأنابيب خلف الفيروس بالزيت المصبوغ ، ويتم رصد تدفق الناقل عن طريق حركة الغضروف المفصلي الناقل للنفط. تتطلب هذه التقنية البديلة معدات وتحضيرا أقل ، ولكنها تتطلب سحب الزيت إلى أنابيب البورسليكات من خلال الطرف المشطوف عن طريق الضغط السلبي وتحميل الناقل عبر نفس الطريق لاحقا. هذا يؤدي حتما إلى آثار النفط التي يتم تسليمها إلى الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، في تجربتنا ، يجب أن يكون قطر أنابيب البورسليكات ~ 350 ميكرومتر لاختراق الجافية حتى عندما تكون مشطوفة ، وبالتالي تسبب أضرارا ميكانيكية أكبر من القنية المعدنية الأرق الموصوفة في هذه الورقة (الشكل 2D). تم استخدام أنابيب 30 جم لأن حمل الإبزيم الحرج مرتفع بما يكفي للتوسط في اختراق الجافية على الرغم من طوله 1-10 سم ، لأنه يناسب أنبوب PTFE بإحكام ، ولأنه نادرا ما يصبح مسدودا. أنابيب 33 G تسد وتنحني بسهولة أكبر وأكثر صعوبة للتزاوج مع أنابيب PTFE. أنابيب 36 G ليست قاسية بما فيه الكفاية لاختراق NHP الأم الجافية.
تقنية حقن بديلة أخرى هي تزاوج خرج مضخة الهواء إلى الجزء الخلفي من ماصة زجاجية محملة بالمتجه ومسحوبة19. يتم إجبار المتجه من طرف الماصة عن طريق ضغط الهواء المباشر والمتقطع من المضخة ، مما يلغي الحاجة إلى الزيت. على غرار طريقة الأنبوب الواحد الموضحة أعلاه ، فإن عدم وجود أي تقاطعات مادية بين الغضروف المفصلي وطرف القنية يقلل من خطر التسرب. ومع ذلك ، فإن المستدق الحاد والنصائح الدقيقة للماصات الزجاجية تمنعها من اختراق NHP dura أو استهداف الهياكل العميقة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT) ، ومنح المعهد الوطني للصحة (NIH) EY023277 (R01 ل YK) ، و EY030441 (R01 ل GH) ، و MH114126 (RF1 إلى JTT ، و Boaz Levi ، و Ed Lein) ، و MH120095 (UG3 ل JTT و GH) ، و EY028902 (R01 ل RS) ، وأصبحت ممكنة بفضل منح المعاهد الوطنية للصحة OD010425 (P51 ل WaNPRC) وصندوق أبحاث الملوك بجامعة واشنطن A148416. يود المؤلفون أن يشكروا ياسمين الشمايلة وفيكتوريا أومستيد على علم الأنسجة ، وريفوجيو مارتينيز على استنساخ النواقل الفيروسية ، وجون ميشيل على المساعدة في معالجة أنسجة المخ NHP.
Materials
| Equipment: Stereotaxic set | |||
| Item | |||
| Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
| Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
| Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
| Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
| Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
| Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
| Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
| Equipment: Cannula | |||
| Item | |||
| 1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
| Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
| Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
| Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
| Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
| Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
| P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
| PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
| Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
| Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
| Vector solution | (homemade) | NA | NA |
| Equipment: Electric air pump set | |||
| Item | |||
| Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
| Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
| Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
| Equipment: General surgery tools | |||
| Item | |||
| Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
| Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
| Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
| Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
| Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
| Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
| Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
| Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
| Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
| Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
| Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
| Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
| Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
| Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
| Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
| Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
| Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
| Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
| Suction | medela | 200-4869 | NA |
| Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
| Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
| Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
| Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
| Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
| Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
| Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
| Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
| Equipment: *cannulas | |||
| Item | |||
| Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
| Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
| PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
| Equipment: **colored oil | |||
| Item | |||
| Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
| Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
| STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma | |||
References
- Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades. Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).
- Kojima, Y., Soetedjo, R. Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades. Brain Research. 1366, 93-100 (2010).
- Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation. Brain Research. 1401, 30-39 (2011).
- De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons. eLife. 9, 52658 (2020).
- El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum. Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).
- Mich, J. K., et al. Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex. Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).
- Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling. Neuron. (21), 00159 (2020).
- Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. Obstacle stepping in patients with Parkinson’s disease. Complexity does influence performance. Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).
- Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning. Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).
- Kleinbart, J. E., et al. A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).
- Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Fredericks, J. M., et al. Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
