Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing

Comprender la organización espacial, los patrones de conectividad y la morfología de estructuras biológicas tridimensionales complejas es esencial para delinear las funciones de células y tejidos específicos. Esto es especialmente cierto en neurociencia, en la que se ha dedicado un tremendo esfuerzo a construir mapas neuroanatómicos de alta resolución del sistema nervioso central^1,2. El examen detallado de las neuronas que componen estos mapas arroja morfologías variadas, con conexiones y ubicaciones que reflejan la función de estos diversos conjuntos de neuronas^3,4. Además, la investigación de las estructuras subcelulares, especialmente las espinas dendríticas, puede informar la madurez de las sinapsis, reflejando así los procesos de desarrollo y los estados de enfermedad neurológica^5,6,7. Por lo tanto, los enfoques que mejoran la resolución y el rendimiento de las imágenes son esenciales para comprender mejor la función cerebral en todas las escalas.

Los avances recientes han ampliado el conjunto de herramientas moleculares y genéticas para marcar y manipular poblaciones de neuronas. El desarrollo de nuevos marcadores fluorescentes, combinado con nuevos métodos de introducción de estos marcadores en las neuronas, permite el etiquetado diferencial de poblaciones de neuronas que interactúan dentro de la misma muestra animal o cerebral^8,9,10,11. Debido a que la luz es dispersada por lípidos opacos, y dado el alto contenido de lípidos del tejido cerebral, las poblaciones neuronales de imágenes se han limitado principalmente a secciones delgadas o se han basado en técnicas avanzadas de microescropia (por ejemplo, microscopía confocal, multiprofónica y de lámina de luz) para obtener imágenes de estructuras profundas. Sin embargo, estos esfuerzos se han visto reforzados en gran medida por los avances en las técnicas de limpieza de tejidos. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) es una de esas técnicas, en la que los tejidos de interés se infunden con monómeros de hidrogel (acrilamida y bis-acrilamida) y luego se lavan con detergentes¹². Los monómeros de hidrogel se hibridan para crear un andamio de hidrogel 3D estable que es ópticamente transparente y permeable a las etiquetas de macromoléculas. Los ácidos nucleicos y las proteínas se mantienen dentro de la matriz hibridada, mientras que los lípidos se eliminan mediante los lavados de detergente (Figura 1). Esto da como resultado un tejido estable que es lo suficientemente rígido como para mantener la forma y orientación originales de las células y las moléculas no lipídicas, mientras que ópticamente lo suficientemente transparente como para obtener fácilmente imágenes de estructuras profundas a alta resolución. Este mantenimiento de la estructura y orientación del tejido permite la obtención de imágenes de rodajas gruesas, preservando así las conexiones de célula a célula y las relaciones espaciales. Además, debido a que la ubicación y disponibilidad de proteínas y ácidos nucleicos se mantiene durante el proceso de limpieza, los tejidos despejados pueden contener marcadores basados en la expresión, así como etiquetas exógenas. Por lo tanto, CLARITY se presta como un método potente para obtener imágenes de grandes cantidades de estructuras cerebrales profundas y las conexiones entre estas estructuras a alta resolución.

El uso de CLARITY mejora en gran medida los enfoques para obtener imágenes de poblaciones neuronales. Esta técnica es especialmente experta en generar grandes cantidades de datos de imágenes. CLARITY funciona bien con múltiples formas de fluorescencia a base de proteínas. Este protocolo utiliza un enfoque basado en lentivirales para etiquetar escasamente las células con EGFP y tdTomato; sin embargo, los alelos reporteros transgénicos que expresan tdTomato o EGFP para etiquetar las células para la reconstrucción se han utilizado rutinariamente. Es importante elegir un fluoróforo que sea fotoestablo y brillante (por ejemplo, EGFP o tdTomato). Además, el uso de un promotor fuerte para expresar el fluoróforo produce un contraste y una calidad de imagen superiores. Los inconvenientes de esta técnica surgen ya que analizar adecuadamente esta gran cantidad de datos puede ser laborioso y requiere mucho tiempo. Los microscopios especializados pueden ayudar a mejorar el rendimiento y disminuir la carga de trabajo. Sin embargo, construir, poseer y / u operar microscopios avanzados a menudo son prohibitivos para muchos laboratorios. Este trabajo presenta un método de alto rendimiento, relativamente rápido y simple para visualizar grandes cantidades de tejido neural a alta resolución utilizando la limpieza de tejidos CLARITY de grandes secciones, combinada con microscopía confocal estándar. Este protocolo describe este enfoque a través de los siguientes pasos: 1) diseccionar y preparar el tejido neural, 2) limpiar el tejido, 3) montar el tejido, 4) obtener imágenes de las rebanadas preparadas y 5) procesar imágenes de cortes completos utilizando la reconstrucción y el análisis del software de visualización de microscopía(Figura 2). Estos esfuerzos dan como resultado imágenes de alta resolución que se pueden usar para analizar poblaciones de neuronas, patrones de conexión neuronal, morfología dendrítica 3D, abundancia y morfología de la columna vertebral dendrítica y patrones de expresión molecular dentro del tejido cerebral intacto.