Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

Compreender a organização espacial, padrões de conectividade e morfologia de estruturas biológicas tridimensionais complexas é essencial para delinear as funções de células e tecidos específicos. Isso é especialmente verdadeiro na neurociência, na qual um tremendo esforço tem sido dedicado à construção de mapas neuroanatomômicos de alta resolução do sistema nervoso central^1,2. O exame minucial dos neurônios que compõem esses mapas produz morfologias variadas, com conexões e locais que refletem a função desses diversos conjuntos de neurônios^3,4. Além disso, a investigação de estruturas subcelulares, especialmente colunas dendríticas, pode informar a maturidade das sinapses, refletindo assim processos de desenvolvimento e estados de doenças neurológicas^5,6,7. Assim, abordagens que melhoram a resolução e o throughput de imagem são essenciais para uma melhor compreensão da função cerebral em todas as escalas.

Os recentes avanços expandiram o kit de ferramentas moleculares e genéticas para marcar e manipular populações de neurônios. O desenvolvimento de novos marcadores fluorescentes, combinados com novos métodos de introdução desses marcadores em neurônios, permite rotulagem diferencial de populações de neurônios interagindo dentro da mesma amostra animal ou cerebral^8,9,10,11. Como a luz é dispersa por lipídios opacos, e dado o alto teor lipídeca do tecido cerebral, as populações neuronais de imagem foram limitadas principalmente a seções finas ou se basearam em técnicas avançadas de microscroba (por exemplo, confocal, multifótons e microscopia de folha de luz) para estruturas profundas de imagem. No entanto, esses esforços têm sido muito reforçados pelos avanços nas técnicas de limpeza de tecidos. Imagem rígida hibridada de lipídida/imunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) é uma dessas técnicas, na qual tecidos de interesse são infundidos com monômeros de hidrogel (acrilamida e bis-acrilamida) e depois lavados com detergentes¹². Os monômeros de hidrogel hibridizam-se para criar um andaime de hidrogel 3D estável que seja opticamente transparente e permeável aos rótulos de macromolécula. Os ácidos e proteínas nucleicos são mantidos dentro da matriz hibridizada, enquanto os lipídios são removidos pelas lavagens de detergente(Figura 1). Isso resulta em um tecido estável que é rígido o suficiente para manter a forma e orientação originais das células e moléculas não lipídicas, enquanto opticamente transparente o suficiente para facilmente imaginar estruturas profundas em alta resolução. Essa manutenção da estrutura e orientação tecidual permite a imagem de fatias grossas, preservando assim conexões célula-célula e relações espaciais. Além disso, como a localização e a disponibilidade de proteínas e ácidos nucleicos são mantidas durante o processo de compensação, os tecidos limpos são capazes de conter marcadores baseados em expressão, bem como rótulos exógenos. Assim, a CLARITY se presta como um método potente para a imagem de grandes quantidades de estruturas cerebrais profundas e as conexões entre essas estruturas em alta resolução.

O uso da CLARITY melhora muito as abordagens para as populações neuronais de imagem. Esta técnica é especialmente adepta à geração de grandes quantidades de dados de imagem. A CLARIDADE funciona bem com múltiplas formas de fluorescência à base de proteínas. Este protocolo utiliza uma abordagem baseada em lentiviral para células de rótulos escassos com EGFP e tdTomato; no entanto, alelos repórteres transgênicos expressando tdTomato ou EGFP para rotular células para reconstrução têm sido usados rotineiramente. É importante escolher um fluoróforo que seja foto-estável e brilhante (por exemplo, EGFP ou tdTomato). Além disso, usar um promotor forte para expressar o fluorohore produz contraste superior e qualidade de imagem. As desvantagens dessa técnica surgem como uma análise adequada dessa grande quantidade de dados pode ser tanto trabalhoso quanto tempo-intensivo. Microscópios especializados podem ajudar a melhorar o throughput e diminuir a carga de trabalho. No entanto, construir, possuir e/ou operar microscópios avançados são muitas vezes proibitivos de custos para muitos laboratórios. Este trabalho apresenta um método de alta produtividade, relativamente rápido e simples de visualizar grandes quantidades de tecido neural em alta resolução usando clareira de tecido DE GRANDE seções, combinada com microscopia confocal padrão. Este protocolo descreve essa abordagem através das seguintes etapas: 1) dissecação e preparação do tecido neural, 2) limpeza do tecido, 3) montagem do tecido, 4) imagens das fatias preparadas e 5) processamento de imagens completas de fatias utilizando reconstrução e análise de software de visualização de microscopia(Figura 2). Esses esforços resultam em imagens de alta resolução que podem ser usadas para analisar populações de neurônios, padrões de conexão neuronal, morfologia dendrítica 3D, abundância e morfologia da coluna dendrítica e padrões de expressão molecular dentro do tecido cerebral intacto.