CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

複雑な三次元生物構造の空間的構成、接続性のパターン、形態を理解することは、特定の細胞や組織の機能を解析するために不可欠です。これは、中枢神経系^1,2の高解像度神経解剖学的地図を構築することに多大な努力が捧げられてきた神経科学において特に当てはまります。これらのマップを構成するニューロンを綿密に調べると、これらの多様なニューロンのセット^3,4の機能を反映した接続と位置を持つ多様な形態が生じます。また、細胞下の構造、特に樹状脊椎の調査は、シナプスの成熟度を知らせることができ、それにより発達過程および神経疾患状態^5、6、7を反映することができる。したがって、イメージングの分解能とスループットを向上させるアプローチは、すべてのスケールで脳機能をよりよく理解するために不可欠です。

最近の進歩は、ニューロンの集団をマーキングし、操作するための分子および遺伝的ツールキットを拡大しています。新しい蛍光マーカーの開発は、ニューロンにこれらのマーカーを導入する新しい方法と組み合わせることで、同じ動物または脳サンプル^{8、9、10、11}内の相互作用ニューロンの集団の微分標識を可能にする。光は不透明な脂質によって散乱され、脳組織の脂質含有量が高いため、ニューロン集団のイメージングは主に細い切片に限定されているか、または高度なマイクロスクロピー技術(例えば、共焦点、多光子、光シート顕微鏡)に依存して画像深部構造に依存している。しかし、これらの取り組みは、組織クリア技術の進歩によって大幅に強化されています。透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイドハイブリジッドイメージング/免疫染色/その場でハイブリダイゼーション適合組織-hYdrogel(CLARITY)は、対象となる組織にヒドロゲルモノマー(アクリルアミドおよびビスアクリルアミド)を注入し、次いで洗剤¹²で洗浄する技術の1つである。ヒドロゲルモノマーはハイブリダイズして、光学的に透明で高分子ラベルに透過性のある安定した3Dヒドロゲル足場を作り出します。核酸およびタンパク質は、ハイブリダイズマトリックス内で維持され、一方、脂質は洗浄剤洗浄によって除去される(図1)。これにより、細胞や非脂質分子の元の形状と配向を維持するのに十分な剛性の安定した組織が生じ、光学的に透明化され、高解像度で深部構造を容易に画像化できます。このように組織構造と配向を維持することで、厚いスライスのイメージングが可能になり、細胞間の接続と空間的関係が維持されます。また、クリアリングプロセス中にタンパク質や核酸の位置や入手可能性が維持されるため、クリアされた組織は、外因性標識だけでなく、発現ベースのマーカーを保持することができます。したがって、CLARITYは、大量の深部脳構造とこれらの構造間の接続を高解像度でイメージングするための強力な方法として自分自身を貸します。

CLARITYの使用は、ニューロン集団をイメージングするアプローチを大幅に改善します。この技術は、特に大量のイメージングデータを生成する上で熟達しています。CLARITYは、タンパク質ベースの蛍光の複数の形態でうまく機能します。このプロトコルはレンチウイルスベースのアプローチを利用して、細胞にEGFPとtdTomatoをスパースにラベル付けします。しかし、再構成のために細胞を標識するtdTomatoまたはEGFPを発現するトランスジェニックレポーターアレスが日常的に使用されてきた。光安定性と明るい(例えば、EGFPやtdTomato)の両方である蛍光色素を選択することが重要です。さらに、強力なプロモーターを使用して蛍光素を発現させることで、優れたコントラストと画質が得られます。この手法の欠点は、この大量のデータを適切に分析すると、労力と時間の両方が必要になる可能性がある場合に生じます。特殊な顕微鏡は、スループットの向上と作業負荷の軽減に役立ちます。しかし、高度な顕微鏡の構築、所有、運用は、多くの研究室にとってコストが高い場合が多い。この研究は、標準的な共焦点顕微鏡と組み合わせた大きなセクションのCLARITY組織クリアリングを使用して、高解像度で大量の神経組織を視覚化する高スループット、比較的迅速かつ簡単な方法を提示する。このプロトコルは、このアプローチを次の手順を通して説明します:1)神経組織を解剖して準備する、2)組織を取り除く、組織を取り付ける、4)準備されたスライスをイメージングする、および5)顕微鏡観察可視化ソフトウェアの再構築と分析を使用して完全なスライス画像を処理する(図2)。これらの取り組みは、ニューロンの集団、ニューロン接続パターン、3D樹状形態、樹状脊椎の豊富さと形態、および無傷の脳組織内の分子発現パターンを分析するために使用できる高解像度画像をもたらす。