Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing
Summary
La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.
Abstract
L’attività cerebrale, i segnali elettrochimici passati tra i neuroni, è determinata dai modelli di connettività delle reti neuronali e dalla morfologia dei processi e delle sottostrutture all’interno di questi neuroni. Come tale, gran parte di ciò che è noto sulla funzione cerebrale è sorto insieme agli sviluppi nelle tecnologie di imaging che consentono ulteriori informazioni su come i neuroni sono organizzati e collegati nel cervello. I miglioramenti nella pulizia dei tessuti hanno permesso l’imaging ad alta risoluzione di spesse fette di cervello, facilitando la ricostruzione morfologica e le analisi delle sottostrutture neuronali, come i pergole dendritiche e le spine. In parallelo, i progressi nel software di elaborazione delle immagini forniscono metodi per analizzare rapidamente set di dati di imaging di grandi dimensioni. Questo lavoro presenta un metodo relativamente rapido di elaborazione, visualizzazione e analisi di spesse fette di tessuto neurale etichettato ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY, la microscopia confocale e l’analisi delle immagini. Questo protocollo faciliterà gli sforzi verso la comprensione dei modelli di connettività e delle morfologie neuronali che caratterizzano i cervelli sani e i cambiamenti in queste caratteristiche che sorgono negli stati cerebrali patologici.
Introduction
Comprendere l’organizzazione spaziale, i modelli di connettività e la morfologia di strutture biologiche tridimensionali complesse è essenziale per delineare le funzioni di cellule e tessuti specifici. Ciò è particolarmente vero nelle neuroscienze, in cui è stato dedicato un enorme sforzo alla costruzione di mappe neuroanatomiche ad alta risoluzione del sistema nervoso centrale1,2. Un attento esame dei neuroni che compongono queste mappe produce varie morfologie, con connessioni e posizioni che riflettono la funzione di questi diversi insiemi di neuroni3,4. Inoltre, lo studio delle strutture subcellulari, in particolare delle spine dendritiche, può informare la maturità delle sinapsi, riflettendo così i processi di sviluppo e gli stati di malattia neurologica5,6,7. Pertanto, gli approcci che migliorano la risoluzione e la produttività dell’imaging sono essenziali per comprendere meglio la funzione cerebrale a tutte le scale.
Recenti progressi hanno ampliato il toolkit molecolare e genetico per marcare e manipolare popolazioni di neuroni. Lo sviluppo di nuovi marcatori fluorescenti, combinato con nuovi metodi di introduzione di questi marcatori nei neuroni, consente l’etichettatura differenziale di popolazioni di neuroni interagenti all’interno dello stesso animale o campione di cervello8,9,10,11. Poiché la luce è dispersa da lipidi opachi e dato l’alto contenuto lipidico del tessuto cerebrale, l’imaging delle popolazioni neuronali è stato principalmente limitato a sezioni sottili o si è affidato a tecniche avanzate di microscropia (ad esempio, microscopia confocale, multi-fotone e a foglio di luce) per l’immagine di strutture profonde. Tuttavia, questi sforzi sono stati notevolmente rafforzati dai progressi nelle tecniche di pulizia dei tessuti. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) è una di queste tecniche, in cui i tessuti di interesse vengono infusi con monomeri di idrogel (acrilammide e bis-acrilammide) e quindi lavati con detergenti12. I monomeri di idrogel si ibridano per creare uno scaffold idrogel 3D stabile che è otticamente trasparente e permeabile alle etichette delle macromolecole. Gli acidi nucleici e le proteine sono mantenuti all’interno della matrice ibridata, mentre i lipidi vengono rimossi dai lavaggi detergenti (Figura 1). Ciò si traduce in un tessuto stabile che è abbastanza rigido da mantenere la forma e l’orientamento originali delle cellule e delle molecole non lipidiche, mentre otticamente abbastanza trasparente da immaginare facilmente strutture profonde ad alta risoluzione. Questo mantenimento della struttura e dell’orientamento dei tessuti consente l’imaging di fette spesse, preservando così le connessioni cellula-cellula e le relazioni spaziali. Inoltre, poiché la posizione e la disponibilità di proteine e acidi nucleici viene mantenuta durante il processo di compensazione, i tessuti eliminati sono in grado di contenere marcatori basati sull’espressione, nonché etichette esogene. Pertanto, CLARITY si presta come un metodo potente per l’imaging di grandi quantità di strutture cerebrali profonde e le connessioni tra queste strutture ad alta risoluzione.
L’uso di CLARITY migliora notevolmente gli approcci all’imaging delle popolazioni neuronali. Questa tecnica è particolarmente abile nel generare grandi quantità di dati di imaging. CLARITY funziona bene con più forme di fluorescenza a base di proteine. Questo protocollo utilizza un approccio basato sul lentivirale per etichettare scarsamente le cellule con EGFP e tdTomato; tuttavia, gli alleli reporter transgenici che esprimono tdTomato o EGFP per etichettare le cellule per la ricostruzione sono stati utilizzati di routine. È importante scegliere un fluoroforo che sia fotostali e luminoso (ad esempio, EGFP o tdTomato). Inoltre, l’utilizzo di un forte promotore per esprimere il fluoroforo produce un contrasto e una qualità dell’immagine superiori. Gli svantaggi di questa tecnica derivano dal fatto che analizzare correttamente questa grande quantità di dati può richiedere sia lavoro che tempo. Microscopi specializzati possono aiutare a migliorare la produttività e ridurre il carico di lavoro. Tuttavia, la costruzione, la proprietà e / o l’uso di microscopi avanzati sono spesso proibitivi per molti laboratori. Questo lavoro presenta un metodo ad alto rendimento, relativamente rapido e semplice per visualizzare grandi quantità di tessuto neurale ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY di grandi sezioni, combinata con la microscopia confocale standard. Questo protocollo descrive questo approccio attraverso i seguenti passaggi: 1) sezionare e preparare il tessuto neurale, 2) eliminare il tessuto, 3) montare il tessuto, 4) imaging delle fette preparate e 5) elaborare immagini di fette complete utilizzando la ricostruzione e l’analisi del software di visualizzazione al microscopio (Figura 2). Questi sforzi si traducono in immagini ad alta risoluzione che possono essere utilizzate per analizzare popolazioni di neuroni, modelli di connessione neuronale, morfologia dendritica 3D, abbondanza e morfologia della colonna vertebrale dendritica e modelli di espressione molecolare all’interno del tessuto cerebrale intatto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prima dell’avvento delle tecniche contemporanee di pulizia dei tessuti, lo studio della morfologia neuronale consisteva nel sezionamento, nell’imaging e nella ricostruzione di sezioni molto sottili adiacenti. L’uso della pulizia del tessuto elettroforetico in combinazione con l’imaging confocale fornisce una visione libera della morfologia neuronale completa. Dagli alberi dendritici intatti, fino al più piccolo bouton sinaptico, l’imaging e la quantificazione della morfologia neuronale non sono mai stati più fattibili….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il nucleo virale NRDDC presso l’Istituto neurologico Jan e Dan Duncan per la produzione di AAV e lentivirus utilizzati in questi esperimenti. Inoltre, vorremmo ringraziare il Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine per l’allevamento dei topi e la manutenzione generale dei topi utilizzati. Vorremmo ringraziare l’American Heart Association per il loro sostegno con il numero di premio 20PRE35040011 e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists per il loro supporto (PJH). Infine, vorremmo ringraziare Logos per aver fornito al nostro laboratorio il sistema di pulizia dei tessuti elettroforetici Logos X-Clarity.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
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