Imagerie et quantification de dendrites neuronales intactes via CLARITY Tissue Clearing

Comprendre l’organisation spatiale, les modèles de connectivité et la morphologie de structures biologiques tridimensionnelles complexes est essentiel pour délimiter les fonctions de cellules et de tissus spécifiques. Cela est particulièrement vrai en neurosciences, dans lesquelles des efforts considérables ont été consacrés à la construction de cartes neuroanatomiques à haute résolution du système nerveux central^1,2. Un examen attentif des neurones qui composent ces cartes donne des morphologies variées, avec des connexions et des emplacements qui reflètent la fonction de ces divers ensembles de neurones^3,4. De plus, l’étude des structures subcellulaires, en particulier des épines dendritiques, peut informer la maturité des synapses, reflétant ainsi les processus de développement et les états de maladie neurologique^5,6,7. Ainsi, les approches qui améliorent la résolution et le débit d’imagerie sont essentielles pour mieux comprendre le fonctionnement du cerveau à toutes les échelles.

Des progrès récents ont élargi la boîte à outils moléculaire et génétique pour marquer et manipuler les populations de neurones. Le développement de nouveaux marqueurs fluorescents, combiné à de nouvelles méthodes d’introduction de ces marqueurs dans les neurones, permet un marquage différentiel des populations de neurones en interaction au sein du même échantillon animal ou cérébral^8,9,10,11. Étant donné que la lumière est diffusée par des lipides opaques et compte tenu de la teneur élevée en lipides des tissus cérébraux, l’imagerie des populations neuronales a été principalement limitée à des sections minces ou s’est appuyée sur des techniques avancées de microscropy (par exemple, la microscopie confocale, multiphotonique et à feuille de lumière) pour imager les structures profondes. Cependant, ces efforts ont été grandement renforcés par les progrès des techniques de nettoyage des tissus. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) est l’une de ces techniques, dans laquelle les tissus d’intérêt sont infusés avec des monomères d’hydrogel (acrylamide et bis-acrylamide) puis lavés avec des détergents¹². Les monomères d’hydrogel s’hybrident pour créer un échafaudage d’hydrogel 3D stable, optiquement transparent et perméable aux étiquettes de macromolécules. Les acides nucléiques et les protéines sont maintenus dans la matrice hybridée, tandis que les lipides sont éliminés par les lavages détergents (Figure 1). Il en résulte un tissu stable suffisamment rigide pour maintenir la forme et l’orientation d’origine des cellules et des molécules non lipidiques, tout en faisant preuve d’une transparence optique suffisante pour imager facilement des structures profondes à haute résolution. Ce maintien de la structure et de l’orientation des tissus permet l’imagerie de tranches épaisses, préservant ainsi les connexions de cellule à cellule et les relations spatiales. De plus, comme l’emplacement et la disponibilité des protéines et des acides nucléiques sont maintenus pendant le processus de nettoyage, les tissus nettoyés sont capables de contenir des marqueurs basés sur l’expression, ainsi que des étiquettes exogènes. Ainsi, CLARITY se prête comme une méthode puissante pour imager de grandes quantités de structures cérébrales profondes et les connexions entre ces structures à haute résolution.

L’utilisation de CLARITY améliore considérablement les approches d’imagerie des populations neuronales. Cette technique est particulièrement efficace pour générer de grandes quantités de données d’imagerie. CLARITY fonctionne bien avec de multiples formes de fluorescence à base de protéines. Ce protocole utilise une approche basée sur lentiviral pour étiqueter de manière éparse les cellules avec EGFP et tdTomato; cependant, des allèles rapporteurs transgéniques exprimant tdTomato ou EGFP pour étiqueter les cellules à reconstruire ont été couramment utilisés. Il est important de choisir un fluorophore qui est à la fois photo-stable et brillant (par exemple, EGFP ou tdTomato). De plus, l’utilisation d’un promoteur puissant pour exprimer le fluorophore donne un contraste et une qualité d’image supérieurs. Les inconvénients de cette technique surviennent car l’analyse correcte de cette grande quantité de données peut prendre à la fois beaucoup de travail et de temps. Les microscopes spécialisés peuvent aider à améliorer le débit et à réduire la charge de travail. Cependant, la construction, la possession et / ou l’exploitation de microscopes avancés sont souvent prohibitifs pour de nombreux laboratoires. Ce travail présente une méthode simple, à haut débit, relativement rapide et simple de visualisation de grandes quantités de tissu neural à haute résolution en utilisant le nettoyage tissulaire CLARITY de grandes sections, combiné à la microscopie confocale standard. Ce protocole décrit cette approche à travers les étapes suivantes : 1) disséquer et préparer le tissu neural, 2) nettoyer le tissu, 3) monter le tissu, 4) imager les tranches préparées et 5) traiter des images de tranches complètes à l’aide de la reconstruction et de l’analyse du logiciel de visualisation par microscopie(Figure 2). Ces efforts aboutissent à des images à haute résolution qui peuvent être utilisées pour analyser les populations de neurones, les modèles de connexion neuronale, la morphologie dendritique 3D, l’abondance et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique et les modèles d’expression moléculaire dans les tissus cérébraux intacts.