Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie, patronen van connectiviteit en morfologie van complexe driedimensionale biologische structuren is essentieel voor het afbakenen van de functies van specifieke cellen en weefsels. Dit geldt met name in de neurowetenschappen, waar enorme inspanningen zijn besteed aan het bouwen van neuroanatomische kaarten met hoge resolutie van het centrale zenuwstelsel^1,2. Nauwkeurig onderzoek van de neuronen waaruit deze kaarten bestaan, levert gevarieerde morfologieën op, met verbindingen en locaties die de functie van deze diverse sets neuronen weerspiegelen^3,4. Bovendien kan onderzoek van subcellulaire structuren, met name dendritische stekels, de volwassenheid van synapsen informeren, waardoor ontwikkelingsprocessen en neurologische ziektetoestanden worden weerspiegeld^5,6,7. Benaderingen die de beeldresolutie en doorvoer verbeteren, zijn dus essentieel voor een beter begrip van de hersenfunctie op alle schalen.

Recente ontwikkelingen hebben de moleculaire en genetische toolkit voor het markeren en manipuleren van populaties van neuronen uitgebreid. De ontwikkeling van nieuwe fluorescerende markers, gecombineerd met nieuwe methoden om deze markers in neuronen te introduceren, maakt differentiële labeling van populaties van interagerende neuronen binnen hetzelfde dier of hersenmonster^8,9,10,11mogelijk. Omdat licht wordt verstrooid door ondoorzichtige lipiden en gezien het hoge lipidengehalte van hersenweefsel, is het afbeelden van neuronale populaties voornamelijk beperkt tot dunne secties of heeft het vertrouwd op geavanceerde microscropy-technieken (bijv. Confocale, multi-foton en lichtbladmicroscopie) om diepe structuren in beeld te brengen. Deze inspanningen zijn echter sterk versterkt door de vooruitgang in weefselreinigingstechnieken. Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) is zo’n techniek, waarbij weefsels van belang worden doordrenkt met hydrogelmonomeren (acrylamide en bis-acrylamide) en vervolgens worden gewassen met detergentia¹². De hydrogelmonomeren hybridiseren om een stabiele 3D-hydrogelsteiger te creëren die optisch transparant is en doorlaatbaar voor macromolecuullabels. Nucleïnezuren en eiwitten worden binnen de gehybridiseerde matrix gehouden, terwijl lipiden worden verwijderd door de wasbeurten van het wasmiddel(figuur 1). Dit resulteert in een stabiel weefsel dat stijf genoeg is om de oorspronkelijke vorm en oriëntatie van cellen en niet-lipidemoleculen te behouden, terwijl het optisch transparant genoeg is om gemakkelijk diepe structuren met hoge resolutie in beeld te brengen. Dit behoud van weefselstructuur en oriëntatie maakt het mogelijk om dikke plakken af te beelden, waardoor cel-tot-celverbindingen en ruimtelijke relaties behouden blijven. Bovendien, omdat de locatie en beschikbaarheid van eiwitten en nucleïnezuren tijdens het clearingproces wordt gehandhaafd, kunnen geklaarde weefsels op expressie gebaseerde markers bevatten, evenals exogene labels. CLARITY leent zich dus als een krachtige methode voor het in beeld brengen van grote hoeveelheden diepe hersenstructuren en de verbindingen tussen deze structuren met hoge resolutie.

Het gebruik van CLARITY verbetert de benaderingen voor het in beeld brengen van neuronale populaties aanzienlijk. Deze techniek is vooral bedreven in het genereren van grote hoeveelheden beeldgegevens. CLARITY werkt goed met meerdere vormen van op eiwitten gebaseerde fluorescentie. Dit protocol maakt gebruik van een lentivirale benadering om cellen spaarzaam te labelen met EGFP en tdTomato; transgene reporter-allelen die tdTomato of EGFP tot expressie brengen om cellen voor reconstructie te labelen, zijn echter routinematig gebruikt. Het is belangrijk om een fluorofoor te kiezen die zowel fotostabiel als helder is (bijv. EGFP of tdTomato). Bovendien levert het gebruik van een sterke promotor om de fluorofoor uit te drukken een superieur contrast en beeldkwaliteit op. De nadelen van deze techniek ontstaan omdat het goed analyseren van deze grote hoeveelheid data zowel arbeids- als tijdsintensief kan zijn. Gespecialiseerde microscopen kunnen helpen de doorvoer te verbeteren en de werklast te verminderen. Het bouwen, bezitten en / of bedienen van geavanceerde microscopen is echter vaak onbetaalbaar voor veel laboratoria. Dit werk presenteert een hoge doorvoer, relatief snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden neuraal weefsel met hoge resolutie te visualiseren met behulp van CLARITY-weefselzuivering van grote secties, gecombineerd met standaard confocale microscopie. Dit protocol beschrijft deze aanpak door middel van de volgende stappen: 1) het ontleden en voorbereiden van het neurale weefsel, 2) het opruimen van het weefsel, 3) het monteren van het weefsel, 4) het in beeld brengen van de voorbereide plakjes en 5) het verwerken van volledige plakbeelden met behulp van microscopie visualisatiesoftware reconstructie en analyse(Figuur 2). Deze inspanningen resulteren in beelden met een hoge resolutie die kunnen worden gebruikt om populaties van neuronen, neuronale verbindingspatronen, 3D-dendritische morfologie, dendritische wervelkolomrijkdom en morfologie en moleculaire expressiepatronen in intact hersenweefsel te analyseren.