التصوير والتحديد الكمي للتشعبات العصبية السليمة عن طريق إزالة الأنسجة الوضوح
Summary
المورفولوجيا التشجرية العصبية غالبا ما تكمن وراء وظيفة. في الواقع، العديد من العمليات المرض التي تؤثر على تطوير الخلايا العصبية تظهر مع النمط الظاهري المورفولوجي. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقوية لتحليل المشجرات التشجرية السليمة والعمود الفقري المرتبط بها.
Abstract
يتم تحديد نشاط الدماغ ، والإشارات الكهروكيميائية التي تنتقل بين الخلايا العصبية ، من خلال أنماط الاتصال في شبكات الخلايا العصبية ، ومن مورفولوجيا العمليات والهياكل الفرعية داخل هذه الخلايا العصبية. على هذا النحو، نشأ الكثير مما هو معروف عن وظيفة الدماغ جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات التصوير التي تسمح بمزيد من البصيرة في كيفية تنظيم الخلايا العصبية وتوصيلها في الدماغ. وقد سمحت التحسينات في تطهير الأنسجة للتصوير عالي الدقة لشرائح الدماغ السميكة، مما يسهل إعادة البناء المورفولوجي وتحليل الهياكل الفرعية العصبية، مثل المشجرات والعمود الفقري. جنبا إلى جنب ، والتقدم في برامج معالجة الصور توفير أساليب لتحليل مجموعات البيانات بسرعة التصوير الكبيرة. يقدم هذا العمل طريقة سريعة نسبيا لمعالجة وتصور وتحليل شرائح سميكة من الأنسجة العصبية المسماة بدقة عالية باستخدام إزالة الأنسجة CLARITY ، والتنظير المجهري confocal ، وتحليل الصور. سيسهل هذا البروتوكول الجهود الرامية إلى فهم أنماط الاتصال ومورفولوجيا الخلايا العصبية التي تميز الأدمغة السليمة، والتغيرات في هذه الخصائص التي تنشأ في حالات الدماغ المريضة.
Introduction
فهم التنظيم المكاني، وأنماط الاتصال، ومورفولوجيا الهياكل البيولوجية ثلاثية الأبعاد المعقدة أمر ضروري لتحديد وظائف خلايا وأنسجة محددة. وهذا صحيح بشكل خاص في علم الأعصاب، حيث تم تكريس جهد هائل لبناء خرائط عصبية تحليلية عالية الدقة للجهاز العصبي المركزي1،2. الفحص الدقيق للخلايا العصبية التي تتألف منها هذه الخرائط تسفر عن مورفولوجيا متنوعة، مع الاتصالات والمواقع التي تعكس وظيفة هذه المجموعات المتنوعة من الخلايا العصبية3،4. وعلاوة على ذلك، التحقيق في الهياكل دون الخلوية، وخاصة العمود الفقري التشجر، يمكن أن تبلغ نضج نقاط الاشتباك العصبي، وبالتالي تعكس عمليات النمو والأمراض العصبية الدول5،6،7. وهكذا، فإن النهج التي تحسن دقة التصوير والإنتاجية ضرورية لفهم أفضل لوظيفة الدماغ على جميع المقاييس.
وقد وسعت التطورات الأخيرة مجموعة الأدوات الجزيئية والجينية لوضع علامات والتلاعب بمجموعات الخلايا العصبية. تطوير علامات الفلورسنت جديدة, جنبا إلى جنب مع أساليب جديدة لإدخال هذه العلامات في الخلايا العصبية, يسمح للتفاضلي وضع العلامات من السكان من الخلايا العصبية التفاعل داخل نفس الحيوان أو عينة الدماغ8,9,10,11. نظرا لأن الضوء مبعثر بواسطة الدهون المبهمة ، ونظرا للمحتوى الدهني العالي لأنسجة الدماغ ، فقد اقتصر تصوير مجموعات الخلايا العصبية في المقام الأول على أقسام رقيقة أو اعتمد على تقنيات ميكروسكوبي متقدمة (على سبيل المثال ، المجهر confocal ، متعدد الفوتونات ، وورقة الضوء) لتصوير الهياكل العميقة. ومع ذلك، فقد تعززت هذه الجهود إلى حد كبير من خلال التقدم في تقنيات إزالة الأنسجة. واضح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة /في الموقع التهجين متوافقة مع الأنسجة hYdrogel (وضوح) هي واحدة من هذه التقنية، التي يتم غرس الأنسجة ذات الاهتمام مع مونومرات هيدروجيل (الأكريلاميد وببيس أكريلاميد) ومن ثم غسلها مع المنظفات12. تهجين مونومرات الهيدروجيل لإنشاء سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد مستقرة شفافة بصريا و نفاذية لتسميات الجزيئات الكبيرة. يتم الحفاظ على الأحماض النووية والبروتينات داخل المصفوفة المهجنة ، في حين تتم إزالة الدهون بواسطة يغسل المنظفات(الشكل 1). وهذا يؤدي إلى نسيج مستقر جامد بما يكفي للحفاظ على الشكل الأصلي والتوجه للخلايا والجزيئات غير الدهنية ، في حين شفافة بصريا بما يكفي لتصوير الهياكل العميقة بسهولة بدقة عالية. تسمح هذه الصيانة لهيكل الأنسجة واتجاهها بتصوير الشرائح السميكة ، وبالتالي الحفاظ على الاتصالات من خلية إلى خلية والعلاقات المكانية. وعلاوة على ذلك، ونظرا للحفاظ على موقع وتوافر البروتينات والأحماض النووية أثناء عملية التطهير، فإن الأنسجة المطهية قادرة على الاحتفاظ بعلامات مستندة إلى التعبير، بالإضافة إلى التسميات الخارجية. وهكذا ، CLARITY يفسح المجال كوسيلة قوية لتصوير كميات كبيرة من هياكل الدماغ العميقة والاتصالات بين هذه الهياكل في دقة عالية.
استخدام وضوح يحسن كثيرا النهج لتصوير مجموعات الخلايا العصبية. هذه التقنية بارعة بشكل خاص في توليد كميات كبيرة من بيانات التصوير. يعمل CLARITY بشكل جيد مع أشكال متعددة من الفلورسينس القائم على البروتين. يستخدم هذا البروتوكول نهجا قائما على العدسية للخلايا ذات التسمية القليلة مع EGFP و tdTomato؛ ومع ذلك، تم استخدام الأليل مراسل المعدلة وراثيا التعبير عن tdTomato أو EGFP لتسمية الخلايا لإعادة الإعمار بشكل روتيني. من المهم اختيار الفلوروفور المستقر والمشراق (على سبيل المثال، EGFP أو tdTomato). بالإضافة إلى ذلك، استخدام مروج قوي للتعبير عن الفلوروفور ينتج تباينا فائقا وجودة صورة. عيوب هذه التقنية تنشأ كما تحليل صحيح هذا الكم الكبير من البيانات يمكن أن تكون كثيفة العمالة والوقت على حد سواء. يمكن للمجاهر المتخصصة المساعدة في تحسين الإنتاجية وتقليل عبء العمل. ومع ذلك، فإن بناء المجاهر المتقدمة وامتلاكها و/أو تشغيلها غالبا ما تكون باهظة التكلفة بالنسبة للعديد من المختبرات. يقدم هذا العمل طريقة عالية الإنتاجية وسريعة وبسيطة نسبيا لتصور كميات كبيرة من الأنسجة العصبية بدقة عالية باستخدام مسح أنسجة CLARITY للأقسام الكبيرة ، إلى جانب المجهر الكونفوفيكال القياسي. يصف هذا البروتوكول هذا النهج من خلال الخطوات التالية: 1) تشريح وإعداد الأنسجة العصبية ، 2) تطهير الأنسجة ، 3) تركيب الأنسجة ، 4) تصوير الشرائح المعدة ، و 5) معالجة صور الشريحة الكاملة باستخدام إعادة بناء وتحليل برامج التصور المجهري(الشكل 2). هذه الجهود تؤدي إلى صور عالية الدقة التي يمكن استخدامها لتحليل مجموعات من الخلايا العصبية، وأنماط اتصال الخلايا العصبية، مورفولوجيا التشجرات ثلاثية الأبعاد، وفرة العمود الفقري التغصني ومورفولوجيا، وأنماط التعبير الجزيئي داخل أنسجة الدماغ سليمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قبل ظهور تقنيات إزالة الأنسجة المعاصرة ، كانت دراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية تتكون من قسم مكثف الوقت والتصوير وإعادة بناء الأجزاء الرقيقة جدا المجاورة. باستخدام تطهير الأنسجة الكهربائية في تركيبة مع التصوير confocal يوفر وجهة نظر دون عائق من مورفولوجيا الخلايا العصبية كاملة. من الأشجار ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر NRDDC الأساسية الفيروسية في معهد جان ودان دنكان العصبي لإنتاج AAVs والفيروسات العدسية المستخدمة في هذه التجارب. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر مركز كلية بايلور للطب المقارن تربية الفئران والصيانة العامة للفئران المستخدمة. نود أن نشكر جمعية القلب الأمريكية على دعمها بموجب الجائزة رقم 20PRE35040011 ، و BRASS: Baylor دعاة البحوث للطلاب العلماء لدعمهم (PJH). وأخيرا، نود أن نشكر Logos على تزويد مختبرنا بنظام إزالة الأنسجة الكهربائية X-Clarity.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
