FlashPack Yaklaşımı ile Basit Şirket İçi Ultra Yüksek Performanslı Kılcal Sütun Üretimi
Summary
Burada optimize edilmiş FlashPack kılcal sütun paketleme prosedürü için bir protokol sunuyoruz. Optimize edilmiş bir protokolün ortak bir 100 bar basınçlı bomba kurulumuna uygulanması, uzun ultra yüksek performanslı kılcal sütunların 10 kat daha hızlı paketlenerek üretilmesini sağlar.
Abstract
Kılcal ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) şu anda LC-MS tabanlı proteomikte örnek ayırma adımı için tercih edİlen bir yöntemdir. Bununla birlikte, kılcal sütunlar daha yüksek akış karşı tiplerine kıyasla çok daha az sağlamdır. Kolay kontaminasyon ve engelleme nedeniyle, genellikle değiştirilmesi gerekir. Bu da onları toplam LC-MS analiz maliyetinin belirgin şekilde pahalı bir parçası yapar. UHPLC kılcal sütunların şirket içinde paketlenerek çok para tasarrufu sağlar ve özelleştirmeye olanak tanır. Bununla birlikte, 100 bar basınçlı bombadaki standart paketleme prosedürü yalnızca HPLC sütunları için iyi çalışır, ancak UHPLC sorbentleri için çok yavaştır. Burada, aynı 100 bar basınçlı bomba kurulumuna uygulanan optimize edilmiş bir FlashPack protokolünün açıklamasını sunuyoruz. Yöntem, ultra yüksek sorbent konsantrasyon bulamacından paketlemeye dayanmaktadır ve uhplc kılcal sütunların makul sürede sınırsız uzunlukta şirket içinde üretimi için geliştirilmiştir.
Introduction
Modern proteomik, en iyi analiz hızını ve hassasiyetini sağlayan ultra yüksek performanslı nano akışlı kromatografi (50-150 μm sütun iç çapı (ID)) ayrımı ile sıvı kromatografisi bağlantılı kütle spektrometresine dayanmaktadır1. Çok sayıda ticari UHPLC kılcal sütun mevcut olsa da, fiyatları, özellikle laboratuvarda birden fazla farklı proje çalıştırıldığında ve projeye özgü kolon kirlenmesi sık karşılaşıkça karşılaşıldığında sarf malzemeleri maliyetinin önemli bir kısmını oluşturur. Ayrıca, şirket içinde sütunların paketlenebilmesi, özel deneye özgü sorbts (örneğin, polyCAT-A sorbent2gibi) ve sütun özelliklerinin hazır bir sütun olarak satın alınamaz.
Bununla başa çıkmak için, birçok laboratuvar kılcal sütunları şirket içinde paketler. Bununla birlikte, 100 bar basınçlı bomba (basınç enjeksiyon hücresi)3 ile ortak paketleme prosedürü, alt 2 μm UHPLC sorbentlerinin yüksek geri basıncı nedeniyle UHPLC kolon ambalajı için uygun değildir ve bu da daha büyük boyutlu HPLC sorbentlerine kıyasla çarpıcı bir paketleme oranı düşüşü ile sonuçlanır. Kısa UHPLC sütunları hala çok yavaş paketlenebilirken, uzun UHPLC sütunlarının üretimi fiziksel olarak imkansızdır4.
Standart kılcal sütun paketleme, 100 bara kadar nispeten düşük basınçlarda ve çok düşük bir bulamaç konsantrasyonu ile yapılır. Bu nedenle, süreci hızlandırmanın iki olası yönü mevcuttur. Paketleme basıncını arttırmak mümkündür5. Bununla birlikte, bu özel ekipman ve pratik olarak laboratuvarda yeni bir yöntemin kurulmasını gerektirir. Başka bir yol, sorbent bulamaç konsantrasyonuartırmaktır 6. Yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonu ambalajı, önceki bir yayında ultra yüksek paketleme basıncı ile birlikte açıklanmıştır7. Bununla birlikte, mevcut paketleme bombalarının çoğunda kullanılan 100 bar basınçta, daha yüksek sorbent konsantrasyonu paketleme hızının yavaşlamasına veya düpedüz paketleme durmasına neden olur. Etkinin son zamanlarda sütun girişindeki sorbent kümelemeden kaynaklandığı gösterildi ve sütun girişini bir sorbent şişenin içindeki mıknatıs çubuğuyla çekiçleyarak sorbent cupola istikrarsızlaştırmanın basit bir hilesi önerildi4. FlashPack adlı elde eden yöntem, aynı 100 bar basınçlı bomba paketleme kurulumunu kullanır. Aynı zamanda, paketleme prosedüründeki küçük ama kritik değişiklikler, çok yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundan paketlemeye ve bir saatten kısa sürede çok uzun UHPLC sütunlarının (50 ila 70 cm ve daha uzun) üretimine izin verirken, aynı parametrelerin ticari sütunlarına eşit ayırma kalitesi ile dakikalar içinde kısa bir sütun üretilebilir4. FlashPack yaklaşımı, hem ters faz (RP) 8 ,9, 10 , 11 ,12,13,14ve hidrofilik etkileşim (HILIC)2kılcal sütunların hazırlanması için birden fazla proteomikprojede başarıyla kullanıldı.
Burada, FlashPack yaklaşımının standart 100 bar basınçlı bomba paketleme prosedürüne uyarlandırıcısı için gereken değişiklikleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şirket içi kılcal sütun ambalajı, birden fazla bağımsız proje üzerinde çalışan büyük laboratuvarlarda oldukça popülerdir. Bununla birlikte, düşük konsantrasyonda sorbent süspansiyondan yaygın bir paketleme yönteminin hızında büyük sınırlamalar vardır ve uzun UHPLC sütunları üretemez.
FlashPack, çok yüksek bir sorbent konsantrasyonundan paketlemeyi mümkün kılan standart paketleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Yöntemin teorik temeli, tüm paketleme süresi boyunca sütun girişindeki sürekli sorbent kümbet dengesinin bozulmasında yatmaktadır. İkincisi teknik olarak sütun girişinin sürekli olarak bir mıknatıs çubuğu ile vurulması ile elde edilir. Kümbet istikrarsızlaştırma yöntemi, ambalaj kurulumunun tamamen ortak paketleme sürecine benzer şekilde kasıtlı olarak geliştirilmiştir, ancak FlashPack’in püf noktası, paketleme işlemi sırasında sorbent bulamaç hazırlama, kılcal konumlandırma ve mıknatıs çubuğu kullanımının ayrıntılarında yatmaktadır.
Sorbent bulamacı, büyük bir çözücü hacminde tortu sorbent tabakası olarak hazırlanır. Basınçlı bomba tabanlı ambalajın sütundan sütuna aynı paketleme koşullarını gerektirmemesi ilginçtir. FlashPack’te, sütun girişinin etrafındaki tam bulamaç konsantrasyonunu asla bilemeyeceğiz. Paketleme işlemi sırasında da değiştiği için tam olarak ölçmek ve kontrol etmek imkansızdır. Ancak, son sütunlar, ambalajın nasıl elde edildiğine bakılmaksızın hala çok tekrarlanabilir4’tür.
Hızlı paketlemenin temeli, verimli sorbent kümbet dengesinin bozulmasında yatmaktadır. Bu nedenle, kılcal damara giren sorbent’i kontrol etmek ve tüm paketleme süresi boyunca en uygun kümbet dengesizleştirme koşullarını korumak önemlidir. Verimli sorbent teslimini önleyebilecek birkaç olası sorun vardır. Bunlara bazı örnekler, hızlı manyetik çubuk dönüşü ile sorbent tabaka resüspensyonu, mıknatıs çubuğu konumlandırmasına yanlış bağıl kılcal veya çok yavaş mıknatıs çubuğu dönüşü nedeniyle verimsiz kümbet dengesizliğidir. Konuların kendileri ve nasıl ele alınacağı protokol bölümünde ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
Sütun paketlendikten sonra, denetlenecek ana sütun parametresi sütun geri basıncıdır. Tablo 5’te listelenen basınç değerleri, popüler alt 2 μm boncuk boyutu sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm) için beklenenlere bir referans noktası sağlar. Aynı zamanda, frit veya çok dar çekilmiş bir yayıcı tarafından ek geri basınç eklenebilir ve bunun için sürekli olarak izlenmelidir. Ambalajlama çekilmiş bir yayıcıya yapılırsa, önce fırfırlı kılcal damarları paketleyerek ve daha sonra kendiliğinden monte edilen frit’in çok fazla eklenip eklenmediğini görmek için kullanımdaki belirli bir sorbent için beklenen sütun geri basıncını ölçmeyi öneririz. Yüksek basınç sorunları için, sorunu tam olarak belirlemek üzere Tablo 1’de sağlanan yönergeleri kullanın.
Deneyimlerimize göre, renk değişikliği, boşluklar ve uygun geri basınç ile dolu bir sütun, vakaların% 100’unda çalışır ve ayırma kalitesini sütun uzunluğundan ve sorbent özelliklerinden beklenebileceklere yakın verir. Renk değişikliği olan bir sütunun düzgün çalışması garanti edilmez, ancak yine de tatmin edici sonuçlar verebilir.
Çoğu zaman, ayırma kalitesiyle ilgili herhangi bir sorun varsa, bunlar sütunun kendisinden değil, ayırma sisteminin diğer bölümlerinden, yani pompalardan, çözücülerden veya bağlantılardan gelir. Özellikle potansiyel olarak zararlı olan herhangi bir sütun sonrası bağlantıdır. Yayıcı ve fırfırlı sütun arasındaki ölü hacimle kötü bağlantı, kılcal kromatografide çok düşük akış hızları nedeniyle büyük tepe genişletme ve kuyruklama sağlar.
FlashPack yaklaşımına özgü bir diğer önemli konu, çalışan bir sorbent bulamaç şişesinde çok pahalı sorbts kullanmasıdır. FlashPack’teki sorbent bulamacın birden fazla kullanım için tasarlandığınızı lütfen unutmayın. Sorbent’e dikkat edin. Sorbent taşlamayı azaltmak için gereksiz mıknatıs çubuğunu karıştırmaktan kaçının-paketleme biter bitmez dönüşü durdurmayı unutmayın. Ve sorbent kurumasını önlemek için açık sorbent şişesini basınçlı bombada bırakmayın. Sorbent bundan sonra hala kullanılabilir olsa da, sorbent bulamacı yeniden yapmak zaman alır.
Yöntem hem fritted kılcal damarlar hem de çekilmiş yayıcı kılcal damarlar için eşit derecede iyi çalışır. FlashPack prensibi, kılcal kimlikler için paketleme oranını 20’den 250 μm’ye yükseltir (daha küçük ve daha büyük test edilmiştir). Ayrıca, hem tam hem de yüzeysel olarak gözenekli olan tüm sorbentler için de geçerlidir, test edebiliriz (yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundaki sorbent kümbet oluşumunun özellikle RP sorbbents ile sınırlı olmadığını yansıtarak). Ayrıca, solvent parametreleri fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre ambalajı açıkça etkiler. Örneğin, daha az viskoz aseton, aynı ambalaj basıncında metanolden daha yüksek ambalajlama oranı sağlar. Bununla birlikte, aynı zamanda metanolden daha az polardır ve birbirine yapışan sorbent parçacıkları azaltır. Etkisi tek başına akış hızı hala yüksek olduğunda ambalajın başlangıcında sorbent kümbet oluşumunu önler. Bununla birlikte, sorbent parçacık etkileşiminde azalma, daha az güvenilir kendi kendine monte edilmiş frit oluşumuna ve paketleme sırasında daha sık çekilmiş uç engellemesine yol açar. Bu nedenle, aseton fritted kılcal damarların paketlenebilmesi için daha iyi olsa da, bulamaç çözücü olarak metanol daha yavaş ancak her iki uç türü için de uygun olan çekilmiş yayıcı kılcal damarlar için daha az uygundur. Heksam veya dikloromethaneden (DCM) paketleme, metanolden asetona geçmenin aşırı durumlarıdır: daha da az polardırlar, bu nedenle sorbent kümbet oluşumunu tamamen önlerler, ancak çekilen yayıcı paketleme için hiç uygun değildirler. Ayrıca, son derece düşük DCM polaritesinin iç kılcal duvara yapışan ve üzerinde kalın bir tabaka yapan sorbent parçacıklara yol açtığı kaydedildi. Katman kalınlığı yavaş yavaş büyür ve rastgele yerel bloklar oluşur, bu da sütunun sorbent olmayan bölgelere ayrılmış birkaç parça halinde paketlenmesini neden eder. C18 Peptid Aeris sorbent için böyle bir etki gözlendi.
Gözlenen bir diğer sorun, YMC Triart C18 sorbent’in metanolde düzgün bir şekilde askıya alınmaması, ancak bir tür pul oluşturmaktı. Ancak, bu, FlashPack ile paketlenmesini ve çok iyi ayırma verimliliği (yayınlanmamış veriler) vermesini engellemez. Bu nedenle, bazı durumlar için en uygun olmasa da, metanol test edilen tüm sorbentler ve sütunlar için çalışmak için en evrensel çözücüydü. Farklı bulamacı çözücülerin kolon ayırma verimliliğini nasıl etkilediğini henüz analiz etmediğimizi belirtmek gerekir. Aynı zamanda, metanolden paketlenmiş sütunların verimliliği zaten aynı sorbentler için ticari sütunlara tamameneşittir 4.
FlashPack, UHPLC sütunlarının paketleme oranını iyileştirmek için mevcut tek yaklaşım değildir. Ultra yüksek basınçlı paketleme7kullanımı ile yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundan hızlı paketleme de mümkündür. FlashPack’in avantajı, sorbent teslimat ve kılcal bağlantılar için özel ultra yüksek basınçlı pompalar ve basınçlı bombalar gerektirmediği için çok daha basit olmasıdır. Aynı zamanda, aşırı basınçlarda paketlenmiş sütunların, düşük basınçlı paketlenmiş sütunlardan daha yüksek ayırma verimliliğine sahip olabileceği gösterilmiştir17. Ve FlashPack karşılaştırmada kullanılanlarla aynı sütunları üretirken4, ambalajlama yöntemini bilmediğimiz, FlashPack sütunlarının ultra yüksek basınçlı paketlenmiş sütunlara karşı nasıl durduğu henüz test edildi.
Özetle, açıklanan FlashPack yöntemi, protokolde yapılan bazı ayarlamalarla laboratuvardaki mevcut ambalaj protokolüne kolayca uyarlanabilirken, kurulum tamamen aynı kalır. HPLC kılcal sütun paketlemeyi dakikalarca hızlandırır ve standart paketleme prosedürü ile açıkça imkansız olan uzun UHP kılcal sütunların üretilmesine izin verir. FlashPack yaklaşımının uygulanmasıyla laboratuvar için zaman ve paradaki genel ekonomi yılda on binlerce Euro olarak sayılabilir. Ayrıca, UHP kılcal sütunları yerel olarak üretebilme yeteneği, mevcut ticari ürünlerle imkansız olan deneme özelleştirme olanaklarını açar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma RSF hibe 20-14-00121 tarafından desteklendi. Yazarlar verimli tartışmalar için P. V. Shliaha’ya (Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi) teşekkür ediyor.
Materials
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- . Pressure injection cells – next advance – laboratory instruments Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021)
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
